刺松藻中甾醇的提取、結構分析及調節血脂活性研究

王 燕，李小翠，王丹麗，徐 萍，趙玉勤，陳 蔭

(浙江海洋大學食品與藥學學院,浙江舟山 316022)

植物甾醇(phytosterols,plant sterol)是一類廣泛存在于植物體的天然生理活性物質，其結構與膽固醇相似，是含3 位羥基的甾體化合物，具有免疫調節、消炎退熱、抗腫瘤、降低血脂和膽固醇及護養皮膚等多種生理功效[1-5]，和動物中膽固醇起相同的作用[6]。POLLAK O J,et al[7]以谷甾醇為藥物，證實了植物甾醇對高膽固醇患者存在一定功效。近年來，植物甾醇以明確的降血脂作用和安全性，引起了人們極大的關注[8-9]。但以上研究應用的植物甾醇以陸源植物甾醇居多，CHEN Zhen,et al[10]對源于海洋的植物甾醇研究中，發現中藥海藻的總甾醇具有很好的降血脂作用。隨著植物甾醇應用范圍的不斷擴大，其制備技術也在不斷提高，選擇和開發簡單有效的生產工藝，是取得較好效益的關鍵[11]。

刺松藻Codium fragile 是一種廣泛分布于溫帶海域的大型海藻，常見于我國黃海和渤海，屬于綠藻門、綠藻綱、管藻目、松藻科、松藻屬。生長于低中潮帶的巖石上[12]。作為一種高膳食纖維、高蛋白、低脂肪、低熱量,且富含鐵、鋅等微量礦物質元素的天然理想保健食品原料[13]，其脂溶性成分主要為烷烴、不飽和脂肪酸、甾醇類成分，具有很好的藥用前景[14]，可用于海洋功能性食品、藥品等的開發，以增加其附加值，但目前國內外對該藻的研究大多集中在其多糖等大分子活性物質，而對于低極性的植物甾醇等小分子化合物則相對較少，對于其提取分離更未進行深入研究[15-17]。本文通過對刺松藻內甾醇的提取及分析，探究甾醇對血脂的作用和影響，以期為深入開發海洋生物資源，為植物甾醇提取提供新的途徑與理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

刺松藻（采自南麂島）；健康SPF 小鼠25 只（雌雄各半，28 g 左右）；高脂高糖飼料（配方為基礎飼料55.8%、豬油18%、蛋白質25%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%）。

總膽固醇（total cholesterol,TC，南京建成生物工程研究所）；甘油三酯（Triglyceride,TG，南京建成生物工程研究所）；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C，上海酶聯生物科技有限公司）；高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C，上海酶聯生物科技有限公司）；磷硫鐵顯色劑（實驗室自配）[12]；乙醇（分析純）；氫氧化鉀（分析純）；正己烷（分析純）；石油醚（分析純）；85%濃磷酸；無水硫酸鈉；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）。

BT125D 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（金壇市億能實驗儀器廠）；A-1000S 水流抽氣泵（上海愛朗儀器有限公司）；N-1100 旋轉蒸發儀（海愛朗儀器有限公司）上；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV-1800PC 型紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；Thermo Fisher 酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺松藻甾醇的提取

將刺松藻用90%乙醇按料液比1:20 在80 ℃下回流提取4 h[18-19]，真空抽濾后濾液在35 ℃下減壓蒸干，用10 mL10% KOH-乙醇溶液將其提取物溶出，加入到具塞試管中，65 ℃下皂化3 h，皂化物離心取上清液，然后加入10 mL 正己烷和15 mL 水進行萃取[15]，分層后取上層有機相，水相用正己烷反復萃取至有機相無色，合并正己烷相，用30%乙醇溶液洗滌至乙醇相無色且呈中性，取出正己烷相經無水Na2SO4脫水10 min，再加入少量活性炭粉末，于60 ℃下水浴攪拌脫色20 min[20]，抽濾得濾液在35 ℃下減壓蒸干得刺松藻甾醇提取物，用高濃度乙醇將其溶出得刺松藻甾醇樣品溶液。

1.2.2 刺松藻甾醇的含量測定

精密稱取谷甾醇標準品，用甲醇溶解并定容配制成1.013 g·L-1的谷甾醇貯備液，再從中精密量取5 mL至25 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，搖勻即得0.202 6 g·L-1谷甾醇對照品溶液[19]。

精密量取谷甾醇對照品溶液0.2 mL，置于干燥具塞試管中，水浴蒸干后，精密加入2 mL 無水乙醇，渦旋混勻，再沿管壁精密加入磷硫鐵顯色劑2 mL，在室溫下立即搖勻穩定10 min，以無水乙醇作為空白參比，使用紫外分光光度計在400～800 nm 范圍內進行掃描，選取最大吸收波長作為檢測波長。

依次精密量取谷甾醇對照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL，按照上述的操作，在530 nm處測定溶液的吸光度。每個點重復3 次，以谷甾醇濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

將刺松藻甾醇樣品溶液水浴蒸干后，精密加入2 mL 無水乙醇，渦旋混勻，再沿管壁精密加入磷硫鐵顯色劑2 mL，在室溫下立即搖勻穩定10 min，以無水乙醇作為空白參比，在530 nm 處測定溶液的吸光度。樣品總甾醇含量按下式計算：

其中：W 為吸光度對應的樣品中甾醇的濃度（mg·mL-1）；V 為定容體積（mL）；t 為稀釋的倍數；m 為樣品總重量（g）。

1.2.3 刺松藻甾醇回流提取工藝的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度進行4 因素3 水平正交試驗設計，以得到甾醇的最佳提取工藝，試驗方案見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test on extraction condition of sterol from apple seed oil

1.2.4 刺松藻甾醇的紅外光譜分析

采用KBr 壓片法，首先將KBr 粉末在真空中干燥至恒重后，在研缽中研磨至粉末，再用壓片機壓制成透明薄片。樣品溶在正己烷中，配制成5 mg·mL-1的溶液，均勻的涂在KBr 薄片上，待溶劑揮發干后進行紅外掃描，其掃描范圍為4 000～400 cm-1，背景掃描次數32 次，分辨率為4.0 cm-1。

1.2.5 刺松藻甾醇的GC-MS 分析

為確定刺松藻甾醇的主要成分,對混合物進行GC-MS 分析。其中GC 條件：采用DB-5ms 氣相色譜柱(0.25 mm×30 m)，進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，柱流速0.8 mL·min-1，起始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃·min-1升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃·min-1升至280 ℃，保持30 min。MS 條件：EI 源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，SCAN 模式，質量掃描范圍為50～500.根據GC-MS 總離子流色譜圖中各組分的質譜，確定分子量，再通過NIST 標準譜庫并參考甾醇標準和參考文獻進行鑒定后，采用面積歸一發計算各甾醇的百分組成[21]。

1.2.6 動物水平調節血脂作用研究

模型建立：30 只受試小鼠適應性喂養基礎飼料7 d，1 周以后尾部采血，測定空腹血清總膽固醇（TC），按TC 水平和體重分為空白對照組、模型組、3 個劑量組[22]，共5 組。對照組給予基礎飼料，其他組給予高脂高糖飼料。對照組和模型組小鼠灌胃0.5 mL 的色拉油，各劑量組給予分別灌胃含有低、中、高劑量的刺松藻甾醇提取物，每天灌胃0.5 mL，植物甾醇3 種劑量以色拉油作溶劑配制，連續45 d，造模期間，自由飲水、攝食[23]。每周稱體重1 次，隔日準確記錄進食量。

血清的制備：最后一次給藥后禁食不禁水5 h，各組小鼠眼眶取血，放入1.5 mL 離心管中，4 ℃下保存，并及時以2 500 r·min-1離心10 min，離心后取血清以備測定用。

指標測定：（1）血清脂質的測定 血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）均根據試劑盒要求采用酶法進行檢測。

（2）肝臟系數的測定 將處死的小鼠分離肝臟，濾紙吸干后稱其重量（g），按下式計算肝臟系數；肝臟系數（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100

（3）動脈硬化指數的測定 動脈硬化指數（AI）=（TC－HDL-C）/HDL-C

數據處理：實驗數據采用SPSS 軟件，經統計分析后以平均值±標準差（x±s）表示，組間差經t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 刺松藻甾醇含量測定

最終谷甾醇標準品溶液的最大吸收波長在530 nm，吸收峰較為平緩，故選擇530 nm 作為檢測波長（圖1）。制作谷甾醇標準曲線，結果見圖2，標準曲線的回歸方程為y=8.393 5x-0.033 9,R2=0.999 4。

圖1 谷甾醇標準品紫外全波長掃描圖Fig.1 Sitosterol standard UV wavelength scanning chart

圖2 谷甾醇標準曲線Fig.2 Standard curve of sitosterol

對刺松藻甾醇樣品溶液進行測定，采用2.1 的標準曲線計算甾醇含量，根據公式得到樣品中甾醇含量為2.06 mg·g-1。

2.2 刺松藻中甾醇回流提取的最佳條件確定

由表2 可知，根據極差R 值大小可以看出影響刺松藻甾醇回流提取的因素順序為乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度＞料液比，其中乙醇濃度對甾醇的提取率影響最大。比較各因素的K 值可以得出最佳因素組合為A2B2C3D3，即回流提取刺松藻中甾醇的最佳條件為料液比1:20，提取時間4 h，提取溫度90 ℃，乙醇濃度95%。

表2 正交實驗結果分析表Tab.2 Results and range analysis of orthogonal test

2.3 刺松藻甾醇的紅外光譜分析

通過紅外光譜對混合物的結構特征進行分析（圖3 所示），3 350 cm-1是羥基的伸縮振動，2 950,2 933和2 892 cm-1處強的吸收峰是飽和CH 的伸縮振動，1 700 cm-1左右是C=C 雙鍵的伸縮振動，1 460 和1 382cm-1是飽和CH 的變角振動，1 040 cm-1左右是C-O 的伸縮振動。綜合分析并參照參考文獻表明，該混合物符合甾醇的基本光譜特征[24]。

圖3 刺松藻甾醇的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of sterols from C.fragile

2.4 刺松藻甾醇的GC-MS 分析

對刺松藻中甾醇進行GC-MS 進行分離和鑒定，所得各峰的質譜經計算機檢索和數據庫比對鑒定出各個甾醇的結構（表3 和圖4）。結果表明刺松藻中甾醇的種類較少，主要含有膽甾醇，24-乙基-膽甾-5,23-二烯-3β-醇和24-甲基-膽甾-5-烯-3β-醇乙酸酯[25]，比例約為1:3:8。

圖4 刺松藻中所含甾醇Fig.4 Sterols in the alga C.fragile

表3 各甾醇的m/z 及百分含量Tab.3 m/z and percents of all kinds of sterols

2.5 刺松藻甾醇對小鼠血脂水平的影響

由表4 可見，實驗45 d 后，對照組和高脂模型組的血清TC 之間存在顯著性差異（P<0.05），對照組的血清TC 明顯低于高脂模型組。實驗組較高脂模型組的血清TC 低，但實驗組之間無顯著性差異。說明刺松藻植物甾醇對小鼠血清TC 有降低作用，但無明顯效果。

表4 刺松藻植物甾醇對小鼠血脂水平的影響（x±s，n=5）Tab.4 Effects of phytosterol on the serum lipid levels in mice

對照組和高脂模型組的血清TG 之間存在顯著性差異（P<0.05），對照組的血清TC 明顯低于高脂模型組。實驗組均與高脂模型組的血清TG 之間存在顯著性差異（P<0.05），且低于對照組血清TG，說明刺松藻植物甾醇能顯著降低小鼠血清TG。實驗組中低劑量組和中劑量組降低血清TG 效果差異不明顯，但高劑量組與其他兩組實驗組降低血清TG 效果差異顯著（P<0.05）。

對照組、高脂模型組、低劑量組和中劑量組之間血清LDL-C 無顯著差異。但中劑量組較對照組和高脂模型組血清LDL-C 低。高劑量組與高脂模型組存在顯著差異（P<0.05），說明高劑量刺松藻甾醇能顯著降低小鼠血清LDL-C。

高脂模型組較對照組血清HDL-C 顯著降低。與對照組比較，實驗組的血清HDL-C 較對照組均略有下降，但各組間差異不顯著。說明刺松藻植物甾醇對血清HDL-C 水平無明顯影響。

2.6 刺松藻植物甾醇對小鼠體重、肝重及肝系數的影響

結果如表5 所示，高脂模型組和實驗組的終體重均較對照組顯著增高（P<0.05）,但實驗組的終體重均較高脂模型組顯著降低（P<0.05），且高劑量組終體重顯著低于低劑量組和中劑量組。實驗組終體重與劑量呈依賴關系，說明刺松藻甾醇能顯著降低小鼠體重。

表5 刺松藻植物甾醇對小鼠體重、肝重及肝指數的影響（x±s，n=5）Tab.5 Effects of phytosterol on weight,liver weight and liver index of mice

高脂模型組較對照組肝重質量增大，低劑量組較高脂模型組肝重質量降低。中劑量組和高劑量組較高脂模型組肝重質量顯著降低（P<0.05），說明刺松藻甾醇能降低肝重質量。

高脂模型組較對照組肝系數顯著增大（P<0.05），低劑量組較高脂模型組肝重質量降低。中劑量組和高劑量組較高脂模型組肝重質量顯著降低（P<0.05），說明刺松藻甾醇能降低肝系數。

2.7 刺松藻甾醇對小鼠動脈硬化指標的影響

LDL-C 與心血管病發作直接相關，而HDL-C 則與心血管病的發作具有相反的關系[26]。結果如表6 所示，高脂模型組較對照組高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇的比值（HDL-C/LDL-C）略有降低。實驗組HDL-C/LDL-C 與劑量呈正相關，說明刺松藻甾醇略有降低HDL-C/LDL-C 水平的作用。高脂模型組和實驗組的高密度脂蛋白膽固醇與總膽固醇的比值（HDL-C/TC）均低于對照組，且高脂模型組和實驗組差別不大，說明刺松藻甾醇對HDL-C/TC 基本無影響。高脂模型組動脈硬化指數（AI）較對照組明顯升高，實驗組較高脂模型組逐漸降低，說明刺松藻甾醇對AI 水平有降低作用。

表6 刺松藻甾醇對小鼠動脈硬化指標的影響（x±s，n=5）Tab.6 Effect of phytosterol on arteriosclerosis indicators in mice

3 結論

刺松藻作為大型野生綠藻中，是東海海域的優勢藻類，對刺松藻活性成分的研究有助于其開發利用。本文對刺松藻中甾醇成分進行細致研究。本文采取了乙醇回流和皂化來提取甾醇，以磷硫鐵試劑作為顯色劑，利用分光光度法進行含量測定。在乙醇回流提取過程中各因素對甾醇含量的影響順序為乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度＞料液比，得到最佳的提取條件為乙醇濃度95%，料液比1:20，溫度95 ℃，提取時間4 h，該工藝條件下提取的甾醇含量為2.14 mg·g-1。通過光譜學和GC-MS 對甾醇進行鑒定，主要含有膽甾醇，24-乙基-膽甾-5,23-二烯-3β-醇和24-甲基-膽甾-5-烯-3β-醇乙酸酯。

血脂異常是動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的危險因素，特別是升高的LDL-C 是動脈粥樣硬化的發生、發展的主要危險因素[27]。本實驗結果顯示，刺松藻甾醇提取物尤其中高劑量條件下能有效降低高脂模型中小鼠的體重、肝重和肝系數，以及小鼠血清TG 和LDL-C，降低AI，從而調節血脂水平。但目前刺松藻中甾醇提取物降血脂方面的研究還未見報道，這有利于深入開發海洋生物資源，有利于刺松藻藥用價值的多元開發利用，也為植物甾醇的提取提供了新的途徑。