酶解南極磷蝦蛋白制備ACE 抑制肽的工藝研究

張 倫，趙國旭，喬倩倩，王 斌，趙玉勤

(浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022)

南極磷蝦Euphausia superba 位于南大洋西南大西洋地區(qū)，是鯨魚、企鵝和海豹的主要食物，也是商業(yè)捕魚物種（如鯖魚、冰魚）的主要食物來源，南極磷蝦也是一種漁業(yè)目標(biāo)物種，其種類約有8 種，統(tǒng)稱為南極磷蝦，其中數(shù)量占最大優(yōu)勢的為南極大磷蝦，一般所稱南極磷蝦通常指南極大磷蝦。而且，目前磷蝦還未經(jīng)過大規(guī)模的開發(fā)，據(jù)估計其生物量為3.42～5.36 億噸[1]，具有極大的應(yīng)用和開發(fā)潛力[2]。根據(jù)劉志東等文獻可知南極磷蝦的蛋白含量為11.9%～15.4%[3]，含有全部的人體必需氨基酸，必需氨基酸的總量達到212.1 mg·g-1蛋白質(zhì)[4]，具有極高的利用價值和經(jīng)濟效益。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是一種鋅蛋白酶，在調(diào)節(jié)血壓中起著重要作用。ACE 水解血管緊張素-I 形成有效的血管收縮劑血管緊張素II，使抗高血壓血管擴張劑緩激肽失活[5]。因此，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性被認為是有效的預(yù)防高血壓。ACE 抑制劑通過抑制人體內(nèi)ACE 酶的活性，鈍化舒緩激肽的，減少血管緊張素Ⅱ的合成，達到使血壓上升的目的[6－7]。因此，合成的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，如卡托普利、依那普利和賴諾普利已被用于治療高血壓，但同時在臨床上會帶來顯著的副作用，如頭痛，惡心，發(fā)熱，皮疹等[8－9]。因此，目前正在開發(fā)可通過食品蛋白酶水解獲得的ACE 抑制劑，其具有安全，低毒，低過敏性等優(yōu)勢，并且已從玉米[10]、魔芋[11]、帶魚脊骨[12]、沙丁魚[13]等多種不同食物蛋白中獲得了具有ACE 抑制活性的肽序列。以ACE抑制肽作為主要成分開發(fā)具有降血壓效果的保健食品，在臨床上可作為一種預(yù)防和輔助治療高血壓的新型手段[14-15]。

ACE 抑制肽在原蛋白序列中不具有活性，但是可以通過酶水解方法從原蛋白中釋放出來。然而已知ACE 抑制肽沒有固定或統(tǒng)一氨基酸序列組成，并且酶解產(chǎn)物中的組分也較為復(fù)雜，增加了ACE 抑制肽的制備難度。因此，從南極磷蝦中制備、篩選高效的ACE 抑制肽具有顯著的應(yīng)用價值和理論意義，值得進一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

南極磷蝦粉，由浙江海力生集團有限公司提供。

1.1.2 實驗試劑

實驗試劑如表1 所示。

表1 實驗試劑Tab.1 The experimental reagents

1.1.3 實驗儀器

實驗儀器如表2 所示。

表2 實驗儀器Tab.2 The experimental instrumernts

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

南極磷蝦→酶解→100 ℃滅活→冷卻→離心→上清液→測定其ACE 抑制活性。

1.2.2 HPLC 法測定ACE 抑制活性[16]

1.2.2.1 試劑的配制

0.1mol·L-1硼酸緩沖液(pH 8.3，0.3 mol·L-1NaCl)：

（1）稱取12.37 g 硼酸固體，加熱溶解后定容至100 mL 備用；

（2）稱取1.907 g 硼砂（Na2B4O7·10H2O），加熱溶解后定容至100 mL 備用；

（3）量取17.5 mL 硼砂溶液和32.5 mL 硼酸溶液混勻，HCl 或者NaOH 調(diào)節(jié)pH 至8.3，然后再加入1.753 2 g NaCl，定容至100 mL 即可；

1 mmol·L-1馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液：稱取適量的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，以超純水為溶劑，配制成1 mmol·L-1馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃冰箱，備用；

0.1U·mL-1ACE 溶液：將0.1 U ACE 溶于1 mL 0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 8.3，0.3 mol·L-1NaCl)中，即可得到0.1 U·mL-1ACE 溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

5 mmol·L-1HHL 溶液：稱取適量的HHL，以0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 8.3，含0.3 mol·L-1NaCl)為溶劑，配成5 mmol·L-1的HHL 溶液，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

活性肽溶液：稱取適量的活性肽粉末，以0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 8.3，含0.3 mol·L-1NaCl)為溶劑配制成一系列濃度的活性肽溶液；

卡托普利溶液：稱取適量卡托普利，以0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 8.3，含0.3 mol·L-1NaCl)為溶劑配制成一定濃度的卡托普利溶液。

1.2.2.2 檢測原理

在體外37 ℃條件下，ACE 能催化其底物類似物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）產(chǎn)生馬尿酸（HA），HA在228 nm 處有特征吸收峰。當(dāng)有ACE 抑制劑（ACEI）存在時，ACE 活性受到抑制，HA 的生成量會減少，可通過判斷HA 的生成量來評價ACE 抑制活性的大小。

HPLC 法測定時，通過計算加入ACEI 前后馬尿酸的峰面積差值來確定ACE 抑制率。

1.2.2.3 色譜條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18 分析型色譜柱(填料粒徑5 μm 4.6 × 250 mm)；檢測波長：228 nm，流速：1.0 mL·min-1；

流動相A：乙腈(含0.1%三氟乙酸)，流動相B：超純水(含0.1%三氟乙酸)，采用等度洗脫方式，流動相A與流動相B 的流動相體積比為25：75；

柱溫：25 ℃；自動進樣，進樣量：10 μL。

1.2.2.4 檢測方法

參考吳建平等[16]的方法采用HPLC 法測定ACE 抑制活性，所有實驗均在1.5 mL EP 管中進行。將180 μL HHL溶液和30 μL 樣品溶液置于1.5 mL EP 管中，于37 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加入15 μL 0.1 U·mL-1的ACE 溶液于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后加入225 μL 1mol·L-1HCl 溶液停止反應(yīng)，即可得到抑制劑反應(yīng)液。反應(yīng)液通過0.45 μm 的濾膜，置于進樣瓶中，加入進樣系統(tǒng)。同時用30 μL 硼酸緩沖鹽溶液(0.1 mol·L-1，pH 8.3，含0.3 mol·L-1NaCl)替代抑制劑溶液作空白對照組。

ACE 抑制活性計算公式如下：

式中：A0為空白組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)；A1為抑制劑組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)；

IC50指的是在一定條件下抑制ACE 酶活性一半時所需要的抑制劑的濃度。并且得出的抑制率與制劑濃度之間并不存在一個線性關(guān)系，因此必須通過做出有關(guān)抑制劑濃度與抑制率關(guān)系的曲線圖，再從圖中查出IC50，并對得出的結(jié)果都進行了3 次重復(fù)測量。

1.2.2.5 方法驗證

（1）馬尿酸與HHL 保留時間驗證

將馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品和HHL 溶液按照上述色譜條件和方法進樣，確定二者保留時間。

（2）馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸

將1 mmol·L-1馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液用超純水稀釋成系列梯度濃度的馬尿酸溶液：0.5、0.1、0.05、0.01 以及0.005 mmol·L-1，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后依照3.2.2.4 的色譜方法進樣，并以馬尿酸峰面積y 對馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度x 進行線性回歸。

（3）卡托普利ACE 抑制活性的測定

將用硼酸緩沖液配制成的不同濃度的卡托普利溶液（0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.13、0.15 μmol·L-1），ACE，HHL，HCl 溶液按照上述方法和色譜條件加入到進樣系統(tǒng)中。

1.2.3 酶解蛋白篩選

以5 種單酶：胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶在各自最佳酶解條件下進行酶解，測定反應(yīng)液的ACE 抑制活性來確定最適酶解蛋白，如表3。

表3 5 種蛋白酶的酶活力及最適溫度和pHTab.3 The enzyme activity,optimum temperature and pH of the five enzymes

1.2.4 酶解工藝優(yōu)化

以1.0 mg·mL-1酶解物的ACE 抑制活性為指標(biāo)篩選出最佳蛋白酶后，根據(jù)響應(yīng)模型試驗設(shè)計原理，確定時間（X1）、溫度（X2）、pH（X3）、加酶量（X4）以及料液比（X5）4 個因素為影響1.0 mg·mL-1酶解物的ACE 抑制活性的因素，并且依據(jù)二次回歸中心組合設(shè)計5 因素3 水平的實驗。采用軟件Design Expert 8.0.6 對酶解工藝進行數(shù)據(jù)處理。響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計如表4。

表4 Box-Behnken 試驗因素水平表Tab.4 Factors and levels in Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE 抑制活性的測定

2.1.1 馬尿酸和HHL 的色譜分離

取1 mmol·L-1的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液、5 mmol·L-1HHL 溶液以及0.5 mmol·L-1馬尿酸和5 mmol·L-1HHL 的混合液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后依照1.2.2.4 的色譜方法進樣，結(jié)果如圖1。

圖1 馬尿酸與HHL 色譜圖Fig.1 The chromatogram about HA and HHL

圖1 顯示：馬尿酸的保留時間為4.43 min，HHL 的保留時間為8.59 min，峰型較好；馬尿酸和HHL 混合物色譜圖看出二者的出峰時間穩(wěn)定，在上述色譜條件下能有效地分離開，不影響馬尿酸的生成量。

2.1.2 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液處理后在HPLC 系統(tǒng)上進樣分析，以馬尿酸的含量即峰面積（mAU·s）對濃度進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 可以看出：馬尿酸的峰面積y（mAU·s）與馬尿酸的濃度x（m mol·L-1）的線性回歸方程為：y=6 052x-4.942 9，R2=0.999 8，說明馬尿酸的峰面積和其濃度呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。因此可以采用此方法測定樣品中馬尿酸的峰面積，從而測定樣品的ACE 抑制活性。

圖2 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The linear relation of HA concentration and peak area

2.1.3 卡托普利ACE 抑制率的測定

根據(jù)1.2.2.3 和1.2.2.4 的色譜條件和方法下，通過對卡托普利進行ACE 抑制活性的測定，并分析，結(jié)果見圖3。

從圖3 可知：卡托普利的IC50值為18 nM，這與文獻[16] 中所報道的卡托普利的體外IC50為7.5×10-10～2.2×10-8mol·L-1相符，進一步證明了該測定方法的可信度和準(zhǔn)確性，可采用該方法進行下一步實驗。

圖3 卡托普利對ACE 的抑制活性Fig.3 Effect of Captopril on ACE inhibitory activity

在1.2.2.3 和1.2.2.4 的色譜條件和方法下，進行ACE 抑制活性的測定，色譜結(jié)果見圖4。圖4a 為空白樣品的對照圖，該圖顯示ACE 與底物HHL 反應(yīng)生成馬尿酸的量；圖4b 為卡托普利對照圖，顯示加入卡托普利后馬尿酸的生成量，圖中馬尿酸的峰面積較小，說明卡托普利有效地抑制了ACE 的活性，阻止了其與底物反應(yīng)；圖4c 為降壓肽樣品圖，該圖顯示加入降壓肽后馬尿酸的生成量減少，峰面積較小，說明降壓肽能抑制ACE 的活性。綜合圖3 可以看出：樣品和卡托普利都有較好的ACE 抑制活性；相同樣品濃度下，加入卡托普利后的峰面積比加入降壓肽后的峰面積小，說明同等條件下卡托普利比樣品的抑制活性略好，但肽與卡托普利相比具有溶解性好，起效快，可直接進入細胞等優(yōu)點，并且少了臨床上的些副作用，因此采用南極磷蝦ACE 抑制肽繼續(xù)進行研究。

圖4 ACE 抑制活性色譜圖Fig.4 The chromatogram of ACE inhibitory activity

2.2 最佳蛋白酶的篩選

將南極磷蝦粉分別用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在各自的最佳水解條件下進行酶解，即在相同的酶解時間和料液比條件下按照圖2 進行酶解。根據(jù)1.0 mg·mL-1酶解物的ACE 抑制率為指標(biāo)篩選最佳酶解蛋白，結(jié)果見圖5。

圖5 5 種酶解產(chǎn)物對ACE 抑制率的影響Fig.5 Effect of five hydrolysates on ACE inhibition rate

圖5 結(jié)果顯示：5 種蛋白酶在各自最佳酶解條件下進行酶解，測定反應(yīng)液的ACE 抑制活性，木瓜蛋白酶其酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率最低，說明其酶解生成的多肽大多不具有抑制ACE酶活的作用；胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解后的抑制活性相近也略低；中性蛋白酶的ACE 抑制活性較好達到了30%以上；胰蛋白酶水解南極磷蝦的ACE 抑制活性最好，在1.0 mg·mL-1的酶解物的ACE 抑制率可達37%這說明酶解的多肽具有抑制ADC 酶活的作用，因此之后的研究選擇胰蛋白酶為最優(yōu)酶解蛋白進行下一步的工藝優(yōu)化。

2.3 酶解工藝優(yōu)化研究

2.3.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表4 中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到ACE 抑制率對酶解時間、溫度、pH、加酶量和料液比的二次多項回歸模型為：Y=33.30+0.18 X1-0.60 X2-3.50 X3+0.45 X4-5.20 X5+4.97 X1X2-3.29 X1X3-2.07 X1X4-2.16 X1X5+3.55 X2X3-5.32 X2X4+3.65X2X5+1.14 X3X4+7.46 X3X5+8.98 X4X5-6.82X12-4.27X22-9.39 X32-3.47 X42-8.65 X52。

2.3.2 響應(yīng)面回歸分析

酶解工藝響應(yīng)面實驗結(jié)果如表5 所示，對模型的行方差分析，結(jié)果如表6 顯示：模型差異性顯著（P=0.033 9<0.05），失擬項（Lack of Fit，P=0.516 6>0.1）差異性不顯著，說明所得的回歸方程誤差較小，擬合較好，因此可以采用該模型和方法進行對南極鱗蝦酶解產(chǎn)物進行分析、預(yù)測ACE 抑制率與各條件之間的關(guān)系。

表5 Box-Behnken 設(shè)計及試驗結(jié)果Tab.5 Box-Behnken experimental analysis and results

表6 二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Tab.6 Variance analysis for the quadratic regression model

從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果的表中可以看出，模型的一次項E（料液比）較顯著；二次項A2、C2與E2均顯著，其中C2和E2極為顯著；交互項DE 顯著。結(jié)果表明各考察因素對酶解工藝參數(shù)的影響具有交互作用，而不是簡單的線性關(guān)系，故該模型可行度高。從分析結(jié)果可以看出，各條件對ACE 抑制率的影響排序為：料液比>pH>溫度>加酶量>時間。

根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面圖，該圖是基于響應(yīng)值在不同實驗條件交互影響而構(gòu)成的一個三維空間曲面，可以預(yù)測和檢驗變量的響應(yīng)值以及確定變量的相互關(guān)系。分析當(dāng)溫度、料液比、酶解時間、加酶量和pH 其中有3 個因素固定時，另外2 個因素及其交互作用對ACE 抑制率的影響。根據(jù)回歸方程做出模型的響應(yīng)曲面及其等高線見圖6（A～J）。

根據(jù)二次回歸方程所得響應(yīng)曲面圖（圖6），用于分析時間、pH、加酶量、料液比及溫度對ACE 抑制率的影響情況。由圖6 可以看出：隨著料液比例的增加，ACE 抑制活性也隨著增大，但當(dāng)料液比例增加到一定的程度后，ACE 抑制活性有下降的趨勢；pH 得在一定程度范圍內(nèi)增大時，ACE 抑制活性有一定的提升，但是超過這個范圍后，ACE 抑制率不增反降了；溫度和加酶量的影響亦是如此，超過一定范圍，ACE 抑制率便有下降的趨勢；酶解時間對ACE 抑制活性沒有明顯的影響。各因素相互之間都有顯著性，均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，從響應(yīng)曲面的陡峭程度可以看出，料液比的影響最為顯著，這與回歸方程分析的結(jié)果一致，可信度較高。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig.6 Response surface for the effect of cross-interaction between different factors

等高線圖的形狀可以反映出兩因素交互作用的強弱和顯著程度，等高線圖如果為橢圓，則表明這2 個因素交互影響明顯，如果為圓形，則表示二者交互不明顯。從圖3～6 可以看出：其中圖A、B、D、及E～J 等高線圖呈橢圓狀，說明兩因素之間影響明顯，而圖C 中等高線形狀趨于圓形，說明在其他三因素固定時，加酶量和時間交互影響不顯著，響應(yīng)曲面也趨于平緩。

對所得方程進行逐步回歸及實驗條件考量，可得到酶解的最優(yōu)工藝條件：pH 8.0，加酶量2.1%，料液比為1:10.1，溫度為50 ℃，時間為5.95 h，酶解物濃度在1.0 mg·mL-1時ACE 抑制率為38.819 3%。

3 結(jié)論

本研究以南極磷蝦作為實驗原材料，以ACE 抑制活性為指標(biāo)，通過對堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶5 種酶進行篩選，得出胰蛋白酶為最佳酶種；采用響應(yīng)面分析的方法通過Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，選擇溫度、時間、加酶量、料液比和pH 作為試驗因子進行五因素三水平試驗，優(yōu)化酶解工藝，采用Design-Expert 8.0.6 軟件得到ACE 抑制率對酶解時間、溫度、pH、加酶量和料液比的二次多項回歸模型為：Y=33.30+0.18 X1-0.60 X2-3.50X3+0.45 X4-5.20 X5+4.97 X1X2-3.29 X1X3-2.07 X1X4-2.16 X1X5+3.55 X2X3-5.32 X2X4+3.65X2X5+1.14 X3X4+7.46 X3X5+8.98 X4X5-6.82X12-4.27X22-9.39 X32-3.47 X42-8.65 X52，分析數(shù)據(jù)可知各條件對ACE 抑制率的影響排序為：料液比>pH>溫度>加酶量>時間，得出最佳酶解工藝為：pH 8.0，加酶量2.1%，料液比為1:10，溫度為50 ℃，時間為5.95 h，酶解物濃度在1.0 mg·mL-1時ACE 抑制率為38.819 3%。

從南極磷蝦中分離ACE 抑制肽，并對其酶解工藝進行了優(yōu)化，為南極磷蝦的高值化利用、功能性食品和新型降壓藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。