新疆穗花婆婆納白粉病病原鑒定

李妍 海艷 方治豪 王凱濤 任毓忠

摘 要 為了研究新疆石河子地區(qū)穗花婆婆納白粉病菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其防治和系統(tǒng)進(jìn)化提供理論依據(jù)，采用顯微形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該病原菌分生孢子梗直立，上串生3～5個(gè)孢子，分生孢子橢圓形到卵圓形，大小為（24～35）μm×（12～19）μm。閉囊殼球形，暗褐色，69～82 μm，附屬絲菌絲狀，無(wú)分支，著生于閉囊殼的下部，7～9根，長(zhǎng)度是閉囊殼直徑的1～3倍。閉囊殼內(nèi)有一個(gè)子囊，子囊近球形或橢圓形，無(wú)足胞或柄，內(nèi)含4～8個(gè)子囊孢子，子囊孢子卵圓形至橢圓形。根據(jù)病原菌的rDNA-ITS序列（566 bp）建立發(fā)育樹(shù)分析可知，其與Podosphaera_fuliginea（登錄號(hào)MF543026和AB046986）聚在1個(gè)進(jìn)化支上，且序列同源性99.0%以上。基于形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)測(cè)定，將引起石河子地區(qū)穗花婆婆納白粉病的病原鑒定為單囊殼白粉菌（Podosphaera. fuliginea）。

關(guān)鍵詞 穗花婆婆納;白粉病菌;病原鑒定;Podosphaera_fuliginea

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.066

穗花婆婆納（Veronica spicata）屬于玄參科（Scrop-

hulariaceae）婆婆納屬，多年生草本，喜光，耐半陰，耐寒、耐旱及瘠薄土壤，花藍(lán)色，是近幾年從國(guó)外引進(jìn)，適宜我國(guó)北方地區(qū)的優(yōu)良宿根花卉。穗花婆婆納株形緊湊，花枝優(yōu)美，花期恰逢仲夏缺花季節(jié)，在炎熱的夏季開(kāi)花不斷，以彌補(bǔ)夏秋季花卉稀少的現(xiàn)狀，是布置花壇、花鏡的優(yōu)良材料，具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值[1-3]。但隨著該種花卉的引進(jìn)和大面積栽植，為許多花卉病害的傳播擴(kuò)散提供了便利，白粉病就是其中之一。白粉病是由白粉病菌專(zhuān)性寄生于植物上導(dǎo)致的真菌病害，主要侵染的花卉植物的地上部分，影響花卉的觀賞價(jià)值和產(chǎn)量[4-7]。2018年夏季，觀察到新疆石河子市區(qū)穗花婆婆納有白粉病為害，病菌感染葉部及莖稈，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)植株都被白粉層覆蓋，影響到了植株葉片的光合作用，可能導(dǎo)致其提早干枯死亡，觀賞價(jià)值降低。國(guó)內(nèi)外關(guān)于穗花婆婆納白粉病的病原主要有單囊殼白粉菌（Podosphaera. fuliginea）和奧倫特高氏白粉菌（Golovinomyces orontii）[8-9]。但引起新疆地區(qū)穗花婆婆納白粉病的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，有必要對(duì)引起新疆地區(qū)的穗花婆婆納白粉病的病原進(jìn)行鑒定，明確病害的在當(dāng)?shù)氐姆植肌楹桶l(fā)生規(guī)律，為穗花婆婆納白粉病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2018年7—9月在石河子大學(xué)進(jìn)行，穗花婆婆納白粉病標(biāo)本采自新疆石河子市區(qū)明珠河公園內(nèi)，采集田間有白粉病癥狀的樣本帶回室內(nèi)進(jìn)行鑒定。

1.2 病害癥狀觀察

從病害發(fā)生初期開(kāi)始，每隔一段時(shí)間觀察田間病害的癥狀變化及病害發(fā)生情況，包括發(fā)病部位、病斑顏色、病斑大小、病株的生長(zhǎng)狀況以及閉囊殼的產(chǎn)生情況等[10-11]。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

采用粘貼法觀察病原菌形態(tài)特征。用透明膠帶粘取新鮮病斑，以水作浮載劑，在顯微鏡下觀察病原菌菌絲及附著胞、分生孢子、分生孢子梗，并測(cè)量相關(guān)數(shù)據(jù)和制作臨時(shí)玻片對(duì)玻片進(jìn)行保濕處理觀察其芽管著生方式。另外，用解剖針挑取或用膠帶粘帖閉囊殼，顯微觀察并測(cè)量閉囊殼的形狀、大小，附屬絲的形態(tài)、數(shù)量、長(zhǎng)度，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)量、形態(tài)、大小以及子囊內(nèi)子囊孢子的數(shù)量、形態(tài)、大小等。依據(jù)觀察和測(cè)定結(jié)果，參照白粉病菌鑒定特征[12-19]，確定引起穗花婆婆納白粉病的病原。

1.4 病原菌rDNA ITS片段的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

1.4.1 病菌基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采集新鮮發(fā)病的葉片后，在室內(nèi)用干凈的毛筆將葉片上的病菌收集，用BioFlux公司真菌基因組DNA提取試劑盒提取大花金雞菊白粉病病原菌基因組DNA。ITS區(qū)通用引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由上海生工生物工程有限公司合成，PCR擴(kuò)增ITS區(qū)片段，電泳觀察目標(biāo)片段的大小[20-21]。

1.4.2 病菌rDNA-ITS區(qū)序列的分析

將PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)片段送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后的結(jié)果在NCBI的GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，獲得與該序列同源性較高的ITS區(qū)序列，同時(shí)通過(guò)查閱資料，下載已報(bào)道的能引起婆婆納屬植物白粉病的病菌ITS區(qū)序列，用Mega 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

發(fā)病初期葉片正面、背面及莖稈均產(chǎn)生白色稀疏的菌絲（圖1-A、B），后期隨著條件適宜，菌絲逐漸濃密并擴(kuò)大至整個(gè)葉面，即為病原菌分生孢子、分生孢子梗和菌絲體，受害葉片顏色加深，為紫褐色（圖1-C）。同時(shí)葉片背面產(chǎn)生黑色小粒點(diǎn)，即閉囊殼，閉囊殼多聚集產(chǎn)生，少散生在葉片背面（圖1-D）。發(fā)病后期，整株葉片和莖稈表面被白粉層覆蓋，莖稈變?yōu)楹稚⒏煽荩~片卷曲，變脆，轉(zhuǎn)為淺褐色甚至干枯，嚴(yán)重影響了穗花婆婆納的觀賞價(jià)值和觀賞時(shí)長(zhǎng)。

2.2 病原的形態(tài)特征

在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，穗花婆婆納白粉病的病原特征表現(xiàn)如下：白粉病菌的無(wú)性世代菌絲無(wú)色或淡色，寬2.44～7.32 μm，附著胞乳突狀，常單生，偶對(duì)生（圖2-A），分生孢子梗直立，不分枝，長(zhǎng)為65～154 μm（圖2-B），上部串生3～5個(gè)分生孢子。分生孢子單胞透明，橢圓至卵圓形、桶形，表面無(wú)纖維狀體，大小為（24～35）μm×（12～19）μm（圖2-C）。其有性世代閉囊殼多聚生少散生在葉片背面，球形，暗褐色，69～82 μm，附屬絲菌絲狀，生于閉囊殼的下部，直或稍彎曲，無(wú)分支，7～9根，0～4個(gè)分隔，附屬絲基部細(xì)胞顏色較深，頂端細(xì)胞無(wú)色透明，長(zhǎng)107～250 μm，是閉囊殼直徑的1～3倍（圖2-D、E）。閉囊殼內(nèi)有一個(gè)子囊，子囊近球形或光橢圓形，無(wú)足胞或柄（圖2-F），子囊大小為（60～85）μm×（50～64）μm，內(nèi)含4～8個(gè)子囊孢子，子囊孢子單胞無(wú)色，卵圓形至橢圓形，大小為16～24×10～20 μm（圖2-F）。該病菌形態(tài)特征與劉鐵志[8]報(bào)道的寄生在玄參科大婆婆納上的單囊白粉菌（Podosphaera fuliginea異名單囊殼）基本一致，初步鑒定引起新疆穗花婆婆納白粉病的病原為單囊白粉菌（P. fuliginea）。

2.3 rDNA-ITS區(qū)序列的測(cè)定和分析

對(duì)穗花婆婆納白粉病菌rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了566 bp的DNA片段，將測(cè)序后的結(jié)果在NCBI的GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與已登錄的來(lái)自中國(guó)和日本寄生穗花婆婆納的單囊白粉菌（Podosphaera fuliginea，登錄號(hào)MF543026和AB046986）同源性最高達(dá)99.0以上，而與寄生于婆婆納屬植物上的其他白粉病菌（Golovinomyces orontii登錄號(hào)分別為AB077652、DQ386696、KF056820和KY660776）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他單囊殼屬白粉菌（Podosphaera）處于不同的分支上（圖3）。由此進(jìn)一步證明，引起新疆石河子市區(qū)穗花婆婆納白粉病的病原為單囊白粉菌（Podosphaera fuliginea）。

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)于婆婆納屬植物上白粉病病原的研究結(jié)果存在一定的差異，其主要病原有兩種，即單囊殼白粉菌（P. fuliginea）和奧倫特高氏白粉菌（G.orontii）[4-5];

P. fuliginea只在中國(guó)內(nèi)蒙古和日本的穗花婆婆納上有發(fā)現(xiàn)，G.orontii在中國(guó)和英國(guó)的波斯婆婆納（V. persica）、意大利的穗花婆婆納以及日本的直立婆婆納（V.arvensis）都有寄生和為害的報(bào)道（部分信息來(lái)自NCBI）。為進(jìn)一步確認(rèn)引起新疆石河子市穗花婆婆納白粉病的病原分類(lèi)地位，本試驗(yàn)基于病菌形態(tài)特征觀察結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)方法，分析了新疆穗花婆婆納白粉病病原菌與其他相關(guān)類(lèi)群rDNA-ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[19-20]，

最終明確了引起新疆穗花婆婆納白粉病的病原菌為單囊白粉菌（Podosphaera fuliginea）;該結(jié)論與劉鐵志[8]鑒定的引起內(nèi)蒙古穗花婆婆納白粉病的病原一致。這是穗花婆婆納白粉病在新疆的首次發(fā)現(xiàn)。今后需對(duì)白粉病在新疆的主要發(fā)生規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查研究，以便為該病害的防控提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-02-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160357）;兵團(tuán)林業(yè)局項(xiàng)目（KC009903）;石河子大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（SRP2018026）。

作者簡(jiǎn)介：李妍（1997—），女，陜西禮泉人，本科在讀，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)。

※為通信作者，E-mail： 404350315@qq.com。