連作與輪作對溫室土壤中真菌多樣性的影響

摘 要 以不同連（輪）作年限種植白肉靈芝的溫室土壤為實驗材料，研究不同連（輪）作年限土壤真菌多樣性的變化趨勢。通過高通量測序技術并結合相關生物信息學方法，分析土壤中真菌ITS1+ITS2區域的豐富度、多樣性指數以及群落結構。結果表明，連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性，子囊菌門、擔子菌門及接合菌門為優勢真菌，擔子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加，輪作后豐度降低。

關鍵詞 白肉靈芝;真菌;多樣性

中圖分類號：S154.3 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.093

土壤中的微生物主要通過吸收和轉化的途徑影響養分的利用，而造成土壤營養水平低下及產品產量、質量下降的原因則可能是微生物種群發生了變化[1]。產品連作年限較久會造成土壤中微生物種群結構單一化，從而造成土壤質量直線下降，土壤pH發生變化甚至于造成產品產量大減或者絕收。而造成產品減產的原因則主要是真菌，如尖孢鐮刀菌、疫霉屬及炭疽菌屬等致病真菌。基于此，從真菌數量、種類等方面，研究連作和輪作對土壤中真菌多樣性的影響，為連作障礙提供理論依據[2-3]。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

試驗于2019年3—8月在西藏自治區現代農業產業示范園區溫室大棚進行。

1.2 試驗材料

5個相鄰的溫室：1）多年未種植白肉靈芝;2）連作白肉靈芝2年;3）連作白肉靈芝2年后輪作種植羊肚菌;4）連作白肉靈芝3年后輪作種植蒜苗;5）連作白肉靈芝3年后換土。

試劑盒：E.Z.N.A.?Soil DNA Kit。

1.3 取樣及保存

5個溫室分別在白肉靈芝未種植及種植后分時間段采取土壤樣品于-20℃冷凍保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤微生物基因組DNA的提取

稱取0.5 g于-20 ℃保存的土壤樣品，按試劑盒的試驗步驟進行微生物總DNA的提取，DNA樣品于-20 ℃保存待用。

1.4.2 試驗流程

提取樣品總DNA后，根據設計得到真菌ITS1+ITS2合成的引物，合并引物接頭，進行PCR擴增。

PCR反應體系：含15 mmol·L-1 MgCl2的10×Buffer 10.0 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL，10 μmol·L-1引物各5.0 μL，5 U·μL-1Taq酶1.0 μL，DNA模板4.0 μL，滅菌去離子水73.0 μL，總體積100 μL。

PCR反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環;72 ℃ 10 min。

文庫建立：對產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用HiSeq PE250進行檢測，由聯川生物技術公司完成測序[4]。

1.4.3 數據處理

試驗數據均采用Excel和SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同連作年限土壤真菌OTU聚類分析

將所有樣品的有效序列進行聚類，按照97%的序列相似度將這些序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），得到每個Cluster的序列及其代表序列（即為OTU），用于統計每個OTU序列和豐度進行下游分析[5]。

由圖1的Venn圖可知，1號溫室總OTUs為448，2號溫室總OTUs為1 390，3號溫室總OTUs為1 211，4號溫室總OTUs為925，5號溫室總OTUs為421;5個樣品中共有的OTUs個數有143個，其中2號溫室特有OTUs個數最多，達到240個（因5號溫室置換土壤過程中導致數據異常，不再對其進行后續分析）。

2.2 不同連作年限土壤真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性也稱為生境內物種多樣性[6]，包括Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon和Simpson指數。利用Alpha多樣性分析方法，對土壤樣品中的OTUs總數和Chao1指數進行分析，可得出連作土壤中真菌的多樣性變化及數值[7]。不同年限連（輪）作下土壤真菌Alpha多樣性的結果如表1所示。

由表1可知，在白肉靈芝生長過程中，輪作及連作土壤中真菌的OTUs總數及Chao1指數均高于未種植靈芝溫室;連作后輪作的品種對溫室土壤真菌群落OTUs總數及Chao1指數有一定的影響。通過Alpha多樣性分析可知，連作與輪作均能夠提高微生物群落多樣性。

2.3 不同連作年限土壤真菌群落門類組成物種分析

2.3.1 不同連作年限土壤真菌物種分類統計

根據物種豐度表，選取豐度最高的20個物種分類，進行相對豐度計算，獲得相對豐度數據，繪制樣品豐度柱狀圖，便于更直觀地進行樣品豐度比較[8-9]。圖2和圖3中橫軸為樣品名稱，每個樣品3個重復，縱軸代表門及屬的相對豐度;不同顏色對應不同物種。由圖2門級別柱狀圖可以看出各溫室土壤中占比最高的真菌為子囊門（Ascomycota），其次分別為擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）;連作增加了擔子菌門的相對豐度，輪作降低了擔子菌門的相對豐度，卻增加了接合菌門的相對豐度。由圖3屬級別柱狀圖可以看出2、3、4號溫室中內生菌屬（Phialocephala）含量較多，1號溫室內生菌屬含量較少;木霉屬（Hypocrea）在各溫室土壤中含量較高;煙色織孢霉屬（Plectosphaerella）在2、4號溫室含量較高，1、3號溫室含量較少;透孢黑團殼屬（Massarina）在2、3號溫室含量較高，4號含量較少，1號溫室沒有;靈芝屬（Ganoderma）除了1號溫室沒有外，在2、3、4均有存在。

3 結論

通過微生物測序技術得出白肉靈芝輪作和連作土壤樣品中真菌的門、屬類別及豐度，發現連作或輪作后均能夠提高微生物群落多樣性，子囊菌門、擔子菌門及接合菌門為優勢真菌，擔子菌門的比例隨連作年限的增加而逐漸增加，輪作后豐度降低，但接合菌門的相對豐度增大。但是仍有很大一部分類別真菌物種尚未鑒定出，尤其是屬級別真菌，所以需要進行進一步的研究探討和鑒定。

參考文獻：

[1] 馬琨，張麗，杜茜，等.馬鈴薯連作栽培對土壤微生物群落的影響[J].水土保持學報，2010，24（4）：229-233.

[2] 周陳，李許，楊明開，等.冬小麥不同生育期土壤微生物及養分動態變化[J].西北農業學報，2008，17（3）：113-116.

[3] 張重義，林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J].中國生態農業學報，2009，17（1）：189-196.

[4] Bokulich N A，Subramanian S，Faith J J，et al.Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J].Nature methods，2013，10（1）：57-59.

[5] Blaxter M，Mann J，Chapman T，et al.Defining operational taxonomic units using DNA barcode data[J].Philosophical transactions of the Royal Society of London，Series B，Biological Sciences，2005，360（1462）：1935-1943.

[6] Sul W J，Cole J R，Jesus E C，et al.Bacterial community comparisons by taxonomy-supervised analysis independent of sequence alignment and clustering[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（38）：14637-14642.

[7] Price M N，Dehal P S，Arkin A P.FastTree 2-Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments[J].Plos One，2010，5（5）：e9490.

[8] Xiong W G，Wang Y L，Sun Y X，et al.Antibiotic-mediated changes in the fecal microbiome of broiler chickens define the incidence of antibiotic resistance genes[J].Microbiome，2018，6：34.

[9] Ren L L，Zhang R B，Rao J，et al.Transcriptionally Active Lung Microbiome and Its Association with Bacterial Biomass and Host Inflammatory Status[J].mSystems，2018，3（5）：e00199-18.

（責任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-01-15

基金項目：西藏白肉靈芝連（輪）作下土壤生物相關性研究（XZ2017ZRG-39）;國家食用菌產業技術體系拉薩綜合試驗站課題（CARS-20-95）;科技富民穩邊專項-西藏特色食用菌高效栽培技術示范課題（XZ201901NA05）。

作者簡介：高磊（1987—），男，甘肅白銀人，碩士，助理研究員，從事食用菌培養等方向的研究。E-mail： 1173835491@qq.com。