草莓、辣椒枯萎病菌的分離、鑒定及化學(xué)防治

王文 李若南 單紅月 居娜 孫蜻蜓 胡莊方 鄭志天

摘 要 由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病及草莓枯萎病是為害辣椒和草莓的主要病害之一。為明確淮安地區(qū)辣椒、草莓枯萎病的病原菌種類及防治方法，采集辣椒、草莓根際土壤樣品，對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離、純化和鑒定。結(jié)果表明，該病原菌為尖孢鐮刀菌辣椒專化型及尖孢鐮刀菌草莓專化型。采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)3種殺菌劑進(jìn)行篩選，其中氟硅唑抑制作用較好，對(duì)尖孢鐮刀菌辣椒專化型的EC50為0.181 7～0.251 7 μg·mL-1，對(duì)尖孢鐮刀菌草莓專化型的EC50為0.076 0～0.212 8 μg·mL-1，且活體藥效實(shí)驗(yàn)表明該藥劑有效。

關(guān)鍵詞 辣椒枯萎病;草莓枯萎病;尖孢鐮刀菌：氟硅唑

中圖分類號(hào)：S436.418;S436.68 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.068

近年來，辣椒、草莓的種植面積越來越大，已成為我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物。辣椒是人們餐桌上較為普遍的食材，其種植面積僅次于大白菜;草莓因果實(shí)色澤亮麗、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，而備受栽培者和消費(fèi)者的喜愛[1-4]。但隨著辣椒的連年種植及種植面積的逐年增多，辣椒病害發(fā)生也越發(fā)嚴(yán)重，其中由鐮刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒生產(chǎn)栽培中最典型的病害之一。我國(guó)辣椒枯萎病發(fā)病率一般為15%～30%，個(gè)別地區(qū)嚴(yán)重時(shí)高達(dá)70%～80%，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著草莓種植面積的不斷擴(kuò)大，品種的不斷更新，頻繁地調(diào)種、引種以及連作也導(dǎo)致了草莓枯萎病蔓延。再加上草莓灰霉病、白粉病、蛇眼病、炭疽病、紅中柱根腐病、根結(jié)線蟲病、病毒病和革腐病等不斷發(fā)生且越發(fā)嚴(yán)重，給栽培者帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于辣椒枯萎病、草莓枯萎病致病菌的報(bào)道有很多。對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的辣椒枯萎病、草莓枯萎病的防治方法一般仍以化學(xué)防治為主，常用惡霉靈、多菌靈和甲基托布津和代森錳鋅等殺菌劑進(jìn)行灌根防治，但因連年使用這些藥劑，防治效果逐年降低，甚至達(dá)到無(wú)法控制的程度[8-9]。由于該病害很難通過植物抗病防御及抗性育種的方法防治，因此研究選用化學(xué)殺菌劑氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯對(duì)辣椒枯萎病和草莓枯萎病進(jìn)行了藥劑實(shí)驗(yàn)。據(jù)報(bào)道，氰烯菌酯對(duì)小麥赤霉病及水稻惡苗病均有良好的防治效果，但對(duì)辣椒枯萎病的防治是否有效果還未見報(bào)道;氟硅唑、吡唑醚菌酯在番茄頸腐病與根腐病的防治上有較好的防治效果[7]，但對(duì)草莓枯萎病的防治是否有效鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)品種為淮安紅椒、紅顏草莓。

供試殺菌劑為氟硅唑、吡醚菌酯和氰烯菌酯，由江蘇農(nóng)藥研究所提供。藥劑存放于0～4 ℃環(huán)境中。

1.2 尖孢鐮刀菌專化型的分離純化與鑒定

從植株根際土壤中分別采取辣椒與草莓土樣10 g，各采取5組土樣。放入250 mL三角瓶中，加入90 mL的無(wú)菌水，在25 ℃的條件下進(jìn)行離心。然后吸取1 mL懸浮液，采用濃度梯度法按照10-3、10-4、10-5和10-6濃度進(jìn)行稀釋，并均勻涂布于含有硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上進(jìn)行培養(yǎng)。菌落生長(zhǎng)完整后，從中篩選出鐮刀菌并保存。

1.2.1 真菌菌絲培養(yǎng)和DNA提取

將分離純化得到的菌株全都轉(zhuǎn)接到PDA平板上，在25 ℃溫度不變的條件下培育3～5 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌碟10～15個(gè)，放入配制好的PDB培養(yǎng)基中，在28 ℃的條件下振蕩培養(yǎng)，再經(jīng)過多次過濾離心等操作后可得到尖孢鐮刀菌菌絲。將得到的菌絲在0～4 ℃下冷藏，作為提取真菌DNA的干組織。采用真菌DNA提取試劑盒對(duì)真菌DNA進(jìn)行提取。

1.2.2 PCR與瓊脂糖凝膠電泳分析

對(duì)不同專化型的尖孢鐮刀菌種群的IGS序列經(jīng)Primer 5設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物對(duì)P1/P2：P1為5′-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3′，P2為5′-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3′。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。通過該引物對(duì)P1/P2對(duì)尖孢鐮刀菌IGS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 尖孢鐮刀菌專化型對(duì)各組殺菌劑的敏感性測(cè)定

用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定尖孢鐮刀菌對(duì)各種殺菌劑的敏感性。將氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯分別溶解在甲醇中，藥劑濃度梯度為：0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.8 mg·mL-1。將尖孢鐮刀菌在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑選生長(zhǎng)均勻的菌落，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌碟，然后將菌碟接種到含有氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯不同濃度梯度的PDA平板上，測(cè)試菌株對(duì)藥劑的敏感性。

25 ℃條件下恒溫連續(xù)培養(yǎng)5 d后測(cè)量各菌株的菌落直徑，以在不含藥劑的平板上生長(zhǎng)的菌株為對(duì)照，根據(jù)公式1計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)量菌落直徑時(shí)選取生長(zhǎng)較為均勻的菌落，取平均值。根據(jù)藥劑濃度的對(duì)數(shù)（X）與抑制率對(duì)應(yīng)的機(jī)率值（Y），求出各菌株對(duì)于3種藥劑的EC50。

1.4 活體藥效實(shí)驗(yàn)

將尖孢鐮刀菌在28 ℃下恒溫連續(xù)培養(yǎng)3～5 d，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌碟10～15個(gè)，放入配置好的PDB培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，經(jīng)過離心過濾等操作后可以得到尖刀鐮孢菌孢子。

將得到的尖刀鐮孢菌孢子接種至草莓根部，接種孢子2 d后，處理組用各種殺菌劑分別灌根，藥劑稀釋1 000倍，每株施用100 mL，每2 d灌藥1次，對(duì)照組采用清水灌根，20 d后觀察植株的生長(zhǎng)發(fā)病情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL、DPS等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

從草莓和辣椒根際土壤中分別分離到3個(gè)菌株（編號(hào)為草莓0號(hào)、3號(hào)和7號(hào)，辣椒0號(hào)、3號(hào)和7號(hào)），他們的菌落和形態(tài)學(xué)特征無(wú)明顯差異。如圖1A所示，平板培養(yǎng)結(jié)果表明，病原菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，菌落呈紅色，外部為白色，氣生菌絲為絨狀。

如圖1B常規(guī)PCR結(jié)果顯示，特異性引物P1/P2可穩(wěn)定地從100 pg·μL-1的尖孢鐮刀菌基因組DNA模板中擴(kuò)增得到一條1 081 bp左右的條帶，而對(duì)土壤中病原菌DNA的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，能清晰得到特異性條帶，長(zhǎng)度約為1 100左右。即可確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中分離所到的菌即為尖孢鐮刀菌。

2.2 不同殺菌劑對(duì)草莓和辣椒枯萎病的防治效果

尖孢鐮刀菌草莓專化型和辣椒專化型的抑菌作用測(cè)定結(jié)果表明，殺菌劑氟硅唑?qū)Ψ蛛x出菌株的抑制效果明顯，在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，隨藥劑濃度的增加，抑菌效果呈明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)。

由表1可以看出，殺菌劑氟硅唑?qū)Ψ蛛x出的尖孢鐮刀菌有很好的抑制作用，對(duì)尖孢鐮刀菌草莓專化型的EC50為0.076 0～0.212 8 mg·L-1，對(duì)尖孢鐮刀菌辣椒專化型的EC50為0.181 7～0.251 7 μg·mL-1。

2.3 尖孢鐮刀菌活體藥效實(shí)驗(yàn)

將尖孢鐮刀菌草莓專化型和辣椒專化型孢子分別接種草莓和辣椒幼苗20 d后觀察幼苗發(fā)病癥狀。結(jié)果顯示，發(fā)病初期葉片稍微卷縮，有些則呈波狀，會(huì)產(chǎn)生畸形葉莖，老葉呈現(xiàn)紫紅色萎蔫，后葉片逐漸變枯黃，最后全株枯死。

如圖2A所示，左側(cè)為成活的無(wú)病害草莓苗，右側(cè)為處理組實(shí)驗(yàn)20 d后情況。對(duì)照組CK無(wú)明顯發(fā)病癥狀;處理組孢子液蘸根并灌清水的草莓苗20 d后枯萎死亡;處理組孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的草莓苗無(wú)發(fā)病癥狀，正常生長(zhǎng)。表明氟硅唑?qū)怄哏牭毒葺畬；途哂幸欢ǖ囊种苹钚裕瑢?duì)于草莓枯萎病的防治有一定的效果。

如圖2B所示，左側(cè)為成活的無(wú)病害辣椒苗，右側(cè)為處理組實(shí)驗(yàn)20 d后的生長(zhǎng)情況。對(duì)照組CK無(wú)明顯發(fā)病癥狀;處理組孢子液蘸根并灌清水的辣椒苗20 d后枯萎死亡;處理組用辣椒3號(hào)和7號(hào)孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗有輕微的發(fā)病癥狀，用辣椒0號(hào)孢子液蘸根并經(jīng)常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗正常生長(zhǎng)。表明氟硅唑?qū)怄哏牭毒苯穼；途哂幸欢ǖ幕铙w抑制效果，對(duì)于辣椒枯萎病的防治有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

草莓和辣椒枯萎病是近年來生產(chǎn)上遇到的較難防治的土傳病害，在我國(guó)一些主要種植區(qū)普遍發(fā)生，為害程度也逐年加重。尤其是在多年連續(xù)種植的重茬地塊發(fā)病率更高，病害暴發(fā)嚴(yán)重時(shí)會(huì)直接造成毀園。

實(shí)驗(yàn)從淮安市農(nóng)科院溫室草莓種植區(qū)中找到疑似枯萎病的植株，從根際土壤中分離出來菌株，確認(rèn)為草莓枯萎病的病原菌尖孢鐮刀菌，并從中選出致病性強(qiáng)的尖孢鐮刀菌，分別從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。通過菌絲生長(zhǎng)速率法，發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)τ谝鸩葺菸〉募怄哏牭毒佬Я己茫珽C50在0.076 0～0.212 8 μg·mL-1。同樣對(duì)辣椒病樣進(jìn)行取樣分離、純化、藥劑防治和活體藥效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)怄哏牭毒苯穼；偷姆佬Я己茫珽C50為0.181 7～0.251 7 μg·mL-1。

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（責(zé)任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-02-26

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（18KJB210001）。

作者簡(jiǎn)介：王文（1997—），男，江蘇宿遷人，本科，從事園藝學(xué)方向的研究。

為通信作者，E-mail： zztsdta@yeah.net。