四種二價鹽離子對北蟲草液體培養的影響

曹丹 白騰飛 劉偉 汪飛 趙瑞華 高瑜 賀曉龍

摘 要 為探究鎂離子、鈣離子、鋅離子、錳離子對北蟲草液體發酵培養的影響，為北蟲草工廠化生產提供技術依據，采用單因素和正交試驗相結合的方法，以北蟲草菌絲生物量為指標，綜合其長勢和培養基狀態，選擇出最優二價鹽離子組合。試驗結果表明，當鎂離子為0.10 mg·mL-1，鈣離子為0.02 mg·mL-1，鋅離子為0.02 mg·mL-1，錳離子為0.02 mg·mL-1時北蟲草的生物量達到最大，得到最優的二價鹽離子組合。

關鍵詞 北蟲草;液體發酵;無機鹽;二價鹽離子

中圖分類號：S567.3+5 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.070

北蟲草又名北冬蟲夏草、蛹草等，屬真菌門，子囊菌亞門，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬，是一大類重要的昆蟲病原真菌[1]。蛹蟲草是蟲草屬的模式種。研究證明，北蟲草與冬蟲夏草在藥化和藥理上十分相似，在功能食品、醫藥和生物學技術方面有很好的食用價值[2]。近幾年，由于市場需求日益擴大，野生的冬蟲夏草已經不能滿足現在的市場需要，所以與冬蟲夏草具有相同作用的北蟲草菌絲體被生產成各種保健營養品，但由于傳統的固體栽培時間長，菌齡不統一等因素，不能滿足現代生產的要求，所以液體發酵培養將成為北蟲草人工栽培的重要方式。液體發酵栽培生長周期短，出菇整齊，有利于接種，有利于工廠化、規模化[3]。本次試驗探究北蟲草液體發酵過程中的二價礦物鹽離子對菌種菌絲的影響，通過試驗比較出適合北蟲草生長的二價鹽離子，為人工液體栽培北蟲草提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

北蟲草CY-1，由延安大學生命科學學院食用菌實驗室提供。

1.1.2 供試藥品

葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、維生素B1、維生素B6、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鈣等。

1.1.3 儀器設備

高壓滅菌器、恒溫培養箱、恒溫搖床、UV-2600紫外可見分光光度計等試驗室常用設備。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

PDA斜面培養基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH自然。

液體培養基：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、維生素B1 20 μg·L-1、維生素B6 10 μg·L-1、pH自然。

1.2.2 供試菌種的活化

取出保存在實驗室超低溫冰箱中的北蟲草菌種，放在室溫條件下，經過12 h的室溫處理，使菌種活化，供試驗使用。

1.2.3 供試菌種的擴大培養

取1.8 cm×20.0 cm的試管，裝入10 mL配制好的PDA培養基，將試管放在高壓滅菌鍋中進行121 ℃、30 min的滅菌，滅菌完成后冷卻制成斜面培養基。利用超凈工作臺，在嚴格控制的無菌條件下，鏟取0.5 cm2菌塊到新制作的PDA培養基上。將接種的PDA斜面試管放置在溫度控制為21 ℃的恒溫培養箱中恒溫培養8～10 d，備用。

1.2.4 菌絲體液體培養

取150 mL的三角搖瓶，加入50 mL已經配制好的培養液，將配制好的培養液在高壓滅菌鍋中進行121 ℃、30 min滅菌，滅菌完成后制成液體培養基，靜置1 d，檢查滅菌情況。利用超凈工作臺，在無菌條件下向培養液中接入新培養的斜面菌種，接種量為0.5 cm2一塊。將接好種的液體培養基在23 ℃靜置24 h，然后置于23 ℃，180 r·min-1的恒溫搖床中連續培養12 d。

1.3 單因素試驗

1.3.1 鎂離子對北蟲草液體發酵的影響試驗

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1的鎂離子替代原有液體培養基中的二價金屬鹽離子，設計5組重復試驗。在培養的過程中測定液體培養基第8天的菌絲生物量，得出相關的具體數據，分析數據，同時觀察菌絲的萌發時間、菌絲球的生長情況、發酵液狀態等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.2 鈣離子對北蟲草液體發酵的影響試驗

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的鈣離子替代原有液體培養基中的二價金屬鹽離子，設計5組重復。在培養的過程中測定液體培養基第8天的菌絲生物量，得出相關的具體數據，分析數據，同時觀察菌絲的萌發時間、菌絲球的生長情況、發酵液狀態等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.3 鋅離子對北蟲草液體發酵的影響試驗

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的鋅離子替代原有液體培養基中的二價金屬鹽離子，設計5組重復。在培養的過程中測定液體培養基第8天的菌絲生物量，得出相關的具體數據，分析數據，同時觀察菌絲的萌發時間、菌絲球的生長情況、發酵液狀態等并做好記錄，制作分析圖表。

1.3.4 錳離子對北蟲草液體發酵的影響試驗

分別用濃度為0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1的錳離子替代原有液體培養基中的二價金屬鹽離子，設計5組重復。在培養的過程中測定培養基第8天的菌絲生物量，得出相關的具體數據，分析數據，同時觀察菌絲的萌發時間、菌絲球的生長情況、發酵液狀態等并做好記錄，制作分析圖表。

1.4 正交試驗

根據單因素試驗的試驗結果，用4種不同二價金屬陽離子的合適離子濃度進行正交試驗。設計正交試驗為4因素3水平表試驗，正交試驗設計表如表1所示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 鎂離子對北蟲草液體培養的影響

根據試驗得到鎂離子濃度在0.00 mg·mL-1、

0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數據分析、整理得到相關數據結果見表2。

根據表2的數據可以看出鎂離子濃度對北蟲草液體發酵生物量的影響：在離子濃度為0.10 mg·mL-1時，北蟲草液體發酵培養得到的生物量最大;離子濃度在

0.00 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1時菌絲的萌發時間較短;離子濃度在0.10 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好，發酵液的相對性狀也最好。綜合以上數據分析可以得出，當鎂離子濃度為0.10 mg·mL-1時單因素試驗的結果最好，所以選擇鎂離子濃度為0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1做正交試驗，進一步探究二價鹽離子對北蟲草液體發酵培養的影響。

2.1.2 鈣離子對北蟲草液體培養的影響

根據試驗得到鈣離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數據分析、整理得到相關數據結果見表3。

根據表3的數據可以得出鈣離子濃度對北蟲草液體發酵生物量的影響。在離子濃度為0.05 mg·mL-1時北蟲草液體發酵培養得到的生物量最大;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌絲的萌發時間較短;離子濃度在0.05 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時發酵液的相對性狀最好。綜合以上數據分析可以得出，當鈣離子濃度為0.05 mg·mL-1時單因素試驗的結果最好，所以選擇鈣離子濃度為0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交試驗，進一步探究二價鹽離子對北蟲草液體發酵培養的影響。

2.1.3 鋅離子對北蟲草液體培養的影響

根據試驗得到鋅離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數據分析、整理得到相關數據結果見表4。

根據表4的數據可以看出鋅離子濃度對北蟲草液體發酵生物量的影響。在離子濃度為0.05 mg·mL-1時北蟲草液體發酵培養得到的生物量最大;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌絲的萌發時間較短;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時菌球的生長狀況最好;離子濃度在0.00 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1時發酵液的相對性狀最好。綜合以上的數據分析可以得出，當鋅離子濃度為0.05 mg·mL-1時單因素試驗的結果最好，所以選擇鋅離子濃度為0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1做正交試驗，進一步探究二價鹽離子對北蟲草液體發酵培養的影響。

2.1.4 錳離子對北蟲草液體培養的影響

根據試驗得到錳離子濃度在0.00 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1時北蟲草菌絲的生長情況，通過數據分析、整理得到相關數據結果見表5。

根據表4的數據可以看出錳離子濃度對北蟲草液體發酵生物量的影響。在離子濃度為0.02 mg·mL-1時北蟲草液體發酵培養得到的生物量最大，菌絲的萌發時間較短，菌球的生長狀況最好，發酵液的相對性狀最好。綜合以上的數據分析可以得出，當錳離子濃度為0.02 mg·mL-1時單因素試驗的結果最好，所以選擇錳離子濃度為0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1做正交試驗，進一步探究二價鹽離子對北蟲草液體發酵培養的影響。

2.2 正交試驗結果

根據正交試驗通過數據分析、整理得到相關數據結果見表6。

由表6可以看出，試驗6的菌絲生物量最高，達到0.432 9 g;其次是試驗4，可達到0.411 5 g;試驗7和試驗9的菌絲生物量最低。通過極差分析的數據對比可以看出，4種二價鹽離子對北蟲草液體菌種菌絲生物量的影響順序為A>C>B>D，其中A是影響北蟲草液體菌種菌絲生物量的最主要因子，其次為C和B，對北蟲草液體菌種菌絲生物量的影響最小的是D，再綜合菌球生長狀況和發酵液性狀可以得出其最佳的培養組合為A2B1C1D2。

3 結論與討論

本試驗分別通過比較各二價鹽離子對北蟲草菌絲生物量、發酵過程中的相關生理特征的影響，運用科學的統計方法和數據分析手段進行試驗以及結果分析，最終得出上述圖表。通過對4種二價鹽離子的單因素試驗，結果表明，二價鹽離子在較低濃度時對北蟲草的生長和發育起到了明顯的促進作用，在離子濃度進一步升高時，逐漸顯現出了相應的抑制和毒害作用。根據單因素的試驗結果，做正交試驗，正交試驗的結果表明當鎂離子為0.10 mg·mL-1、鈣離子為0.08 mg·mL-1、鋅離子為0.02 mg·mL-1、錳離子為0.02 mg·mL-1時北蟲草的菌絲干重達到最高，得到最佳二價鹽離子組合為A2B1C1D2。

本試驗因為實際試驗室儀器和試驗環境的限制，無法對優化的北蟲草液體培養基培養過程中的各種理化性質進行分子水平鑒定，為了促使這四種二價鹽離子更好更穩定地應用于生產，還需做后續的配套出菇試驗，進行進一步的探索和研究。

參考文獻：

[1] 于溢，安家彥.蛹蟲草胞外多糖的提取和純化[J].大連輕工業學院學報，2000，19（4）：268-270.

[2] 呂作舟.食用菌栽培學[M].北京：高等教育出版社，2010.

[3] 倪賀，李航海，黃文芳，等.北蟲草及其活性成分的研究與開發[J].科技導報，2007，25（15）：75-79.

（責任編輯：趙中正）

收稿日期：2020-02-21

基金項目：陜西省重點研發計劃一般項目“北蟲草種質資源引進與栽培技術研究”（2020NY-078）;延安市重大科技成果轉化資金專項項目“延安地區北蟲草栽培技術示范與推廣應用推廣”（2017CGZH-03）;延安市重點研發計劃產業關鍵核心技術創新項目“延安北蟲草種質資源引進與栽培技術研究”;延安大學產學研合作項目“延安地區北蟲草人工栽培及初加工研發與利用”（CYFP201902）;陜西省大學生創新創業訓練計劃項目“幾種二價離子對北蟲草人工栽培的影響”（S201910719008）。

作者簡介：曹丹（1996—），女，陜西長武人，本科在讀，研究方向為食用菌栽培。

為通信作者，E-mail： ydhelong@163.com。