PEG模擬干旱脅迫對大葉醉魚草種子萌發及幼苗生理特性的影響

李新蕾 李葉芳 關文靈

關鍵詞：大葉醉魚草;干旱脅迫;種子萌發;幼苗生長;抗逆生理指標;抗旱性

世界上有1/3以上的土地處于干旱和半干旱地區[1]。我國現有干旱區面積占國土總面積的383%[2-3]。干旱是影響植物分布和生長發育的主要環境因子之一，其危害程度在諸多非生物脅迫中占首位[4]。研究植物干旱脅迫響應機制、評價其抗旱性，將為提高植物水分利用效率、提高植物抗旱性能、選育抗旱優良品種、發展高產耐旱農業提供理論指導，同時選擇適生植被對受損生態系統進行植被修復、恢復和人工生態系統的建立是非常有效的環境治理途徑[5]。

在干旱環境下，種子萌發和幼苗生長階段是決定植物能否正常生長的關鍵時期，而耐旱性較好的植物，其種子在缺水環境下常常會形成特殊的萌發機制以確保萌發與繁衍。同時干旱脅迫可引起植物幼苗失水，誘發滲透脅迫及活性氧損傷。為了保持體內的水分平衡，使細胞發揮正常功能，抵御干旱脅迫傷害，植物的細胞液滲透勢會降低，氣孔關閉推遲，同時酶促系統中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）等的合成活動增強[6-8]。聚乙二醇（PEG）作為一種滲透調節劑，能較為理想地模擬干旱環境，具有簡便快速、重復性好、周期短等優點，已被廣泛應用于種子和幼苗干旱脅迫等相關試驗中，并在園林植物羅布麻[9]、小雀花[10]、玉帶草[11]等種子種苗的抗旱特性方面取得了較好的研究成果。

大葉醉魚草是醉魚草屬（Buddleja L.）植物中具有很高觀賞價值的種類，既可作為庭園觀賞植物，也是很好的生態修復植物。目前，在歐洲引種栽培的醉魚草屬品種已超過120個，是歐美園林植物中最流行的觀賞灌木之一。我國雖有豐富的醉魚草屬種質資源，但還沒有進行系統的發掘利用[12]。目前，國內外對大葉醉魚草的研究主要集中在其藥用成分及殺蟲成分上，關于其抗性的研究較少，且主要研究其對重金屬的耐性。本試驗以大葉醉魚草為材料，通過PEG-6000人工模擬不同程度的干旱脅迫，研究干旱脅迫對大葉醉魚草種子萌發、滲透調節物質、抗氧化酶系統等生理生化特性的影響，以期明確大葉醉魚草種子及幼苗對干旱環境的適應機制，為大葉醉魚草在園林及在生態修復中的應用提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大葉醉魚草種子于2018年5—6月采自云南省昆明市，采集后保存于4 ℃冰箱中。2018年5—8月在云南農業大學園林園藝學院實驗室進行PEG-6000模擬干旱脅迫下種子萌發試驗。2018年6月在云南農業大學溫室進行播種育苗，2018年9月移至云南農業大學園林園藝學院實驗室，進行PEG-6000模擬干旱脅迫下幼苗生長試驗。

1.2 試驗設計

1.2.1 種子萌發試驗 選取大小均勻的優質大葉醉魚草種子，先用1%體積分數的次氯酸鈉浸泡消毒30 min，再用蒸餾水沖洗直至無次氯酸鈉后待用。以培養皿（直徑 9 cm，內鋪有濾紙）作為發芽床，將供試種子均勻排布在加有等量、質量分數（下同）分別為0（蒸餾水，CK）、5%、10%、15%、20%、25%的PEG-6000水溶液的發芽床中，每床50粒，置于光照培養箱中進行萌發測定，培養溫度為25 ℃、光照時間為12 h/d。每天向濾紙上加蒸餾水或PEG-6000水溶液以保持原始質量，每處理重復3次。每天18：00觀察并記錄大葉醉魚草種子萌發情況，種子發芽的標準為種子露出胚根，連續3d種子發芽數不足供試種子數的1/100視為萌發結束，于 16 d 后結束試驗。記錄發芽啟動時間、發芽持續時間，統計發芽勢，最后計算發芽率、發芽指數。計算方法或公式如下：

發芽啟動時間：從發芽試驗開始到第1粒種子開始萌發所需時間（d）;

發芽持續時間：第1粒種子開始萌發到萌發結束所需時間（d）;

發芽率（GR）=種子發芽數/供試種子總數×100%;

發芽勢=規定時間內發芽種子總數/供試種子總數×100%;

發芽指數（GI）=∑（在不同時間的發芽數/對應的發芽所用時間）。

1.2.2 幼苗模擬干旱脅迫試驗 將營養土和珍珠砂按體積比3 ∶ 1配成基質，等量分裝于塑料盆（16 cm×18 cm）中，每盆種4株幼苗，添加適量的蒸餾水后放入人工氣候箱中進行培養。光照條件為白天12 h（25 ℃），夜晚12 h（15 ℃），進行模擬干旱脅迫處理。根據種子萌發試驗的結果，設置 PEG-6000 水溶液質量分數分別為10%、20%、30%及對照（蒸餾水，CK），每個處理設3次重復，每個重復2盆。每天18：00用稱質量法補充PEG-6000水溶液至原始質量，分別于干旱脅迫處理后3、6、9 d，取幼苗葉片放入液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于測定幼苗葉片的各項生理指標。

1.3 測定指標及方法

SOD活性采用氮藍四唑（NBT）法測定，單位為U/g;過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定，以1 min內D410 nm變化0.01為1個酶活性單位（U）;CAT活性采用紫外吸收法測定，以1 min內D240 nm減少0.1的酶量為1個酶活性單位（U）;丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，μg/g;脯氨酸（Pro）含量的測定采用酸性茚三酮法，μg/g。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013軟件對數據進行處理，測定結果表示為“平均值±標準差”形式，用SPSS 18.0軟件進行方差分析，用Duncans法進行單因素比較分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對大葉醉魚草種子萌發的影響

大葉醉魚草種子萌發進程見圖1，可見對照組與5%、10%PEG脅迫處理的種子在培養4 d時開始啟動發芽，5 d時大量萌發，平均萌發種子數分別為74、72、32粒;15%PEG脅迫處理種子到培養7 d時有個別重復啟動發芽;20%及以上質量分數PEG脅迫處理下種子未見萌發。

同時，大葉醉魚草種子發芽率、發芽勢、發芽指數隨PEG質量分數的加大而呈逐漸下降的趨勢（表1），且影響效應隨PEG質量分數不同呈現出差異性。在發芽率方面，5%、10%PEG脅迫處理與對照比較差異不顯著，15%脅迫處理與對照間差異顯著（P<0.05）;在發芽勢、發芽指數方面，5%PEG脅迫處理與對照間差異不顯著，10%、15%PEG脅迫處理與對照比較差異顯著（P<0.05）;15%PEG脅迫處理下大葉醉魚草種子萌發的各項指標急劇下降，與對照間差異均顯著（P<0.05），發芽率僅為對照的64.43%;在發芽啟動時間方面，除15%PEG脅迫處理在培養7 d啟動發芽外，0～15% PEG處理均在培養4 d開始發芽;PEG質量分數在20%及以上時則已完全抑制了大葉醉魚草種子萌發，各項測定指標全部為0。

2.1 干旱脅迫對大葉醉魚草幼苗葉片游離脯氨酸和丙二醛含量的影響

游離脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，能夠參與植物細胞水勢的調節[13]。從圖2-A可以看出，大葉醉魚草幼苗中游離脯氨酸的含量隨著PEG脅迫濃度的增加和脅迫時間的延長而持續上升，并顯著高于同期對照（P<0.05）。其中10%、20%PEG脅迫處理游離脯氨酸含量上升速度較30%PEG脅迫處理慢，其間無明顯差異;30%PEG脅迫處理下游離脯氨酸含量上升幅度較大，在3、6、9 d時游離脯氨酸含量分別為177.29、239.75、273.821 μg/g，分別是同期對照組的2.29、2.635、2878倍。表明大葉醉魚草幼苗體內會積累較多的脯氨酸來適應干旱環境。

另外，干旱脅迫初期處理3 d時，大葉醉魚草幼苗MDA含量隨著脅迫溶液質量分數的增加而上升（圖2-B），但變化幅度較小，而各處理組與對照相比仍差異顯著（P<0.05）;在處理6、9 d時，10%、20%PEG脅迫處理幼苗MDA質量分數上升不明顯，但與對照組相比仍差異顯著（P<0.05），30%PEG脅迫處理MDA含量持續升高，且幅度增大。結果表明，隨著干旱脅迫時間延長，大葉醉魚草幼苗可以抵抗一定程度的干旱脅迫誘導的膜質過氧化作用傷害，且得到明顯緩和，但干旱脅迫程度過高仍會導致大葉醉魚草幼苗質膜出現明顯損壞。

2.2 干旱脅迫對大葉醉魚草幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧酶的主要功能是清除 O-2 ·，降低氧自由基對細胞膜系統的傷害，其活性高低是評價植物抗旱性的重要指標之一[14]。CAT通過與SOD起協同作用，將植物體內的H2O2轉化成H2O，以保持體內的活性氧在較低水平上[15]。隨著PEG模擬干旱脅迫程度的加強，各時期大葉醉魚草幼苗SOD活性均表現出逐漸升高的變化趨勢，且處理組始終顯著高于同期對照組（P<0.05）;隨著處理時間的延長，各處理SOD活性基本呈先上升后下降的變化趨勢，20% PEG脅迫處理6 d時，大葉醉魚草幼苗SOD活性為231.23 U/g，是同期對照組的1.47倍（圖3-A）。隨著PEG脅迫強度的增加，大葉醉魚草幼苗CAT活性呈逐漸上升的趨勢;隨著脅迫時間的延長，大葉醉魚草幼苗CAT活性均表現出明顯的先上升后下降的趨勢，但各組均在處理6 d時具有最大值，30%PEG脅迫處理在在6 d時的CAT活性最強，達47.24 U/（g·min），為同期對照組的17.56倍（圖3-B）。在PEG模擬干旱脅迫處理下，大葉醉魚草幼苗POD活性的變化動態與SOD、CAT稍有不同。干旱脅迫處理組的POD活性均顯著高于同期對照組（P<0.05），隨處理時間延長，各處理組均表現出先下降后上升的趨勢，并在處理后3 d時出現最高活性，30%PEG脅迫處理在處理3 d時活性最強，達 98.03 U/（g·min），為同期對照的6.44倍（圖3-C）。表明大葉醉魚草幼苗在遭受干旱脅迫時，體內抗氧化酶體系增強，能夠發揮清除活性氧的作用，以減輕過氧化傷害。

3 結論與討論

3.1 干旱脅迫對大葉醉魚草種子萌發的影響

干旱脅迫是影響植物生長發育的重要環境因子之一，而植物種子萌發和幼苗生長階段是對外界環境變化響應最為敏感和脆弱的時期[16]。因此，通過模擬干旱環境來考察植物種子萌發和幼苗生長情況，評價其應對干旱脅迫的生理機制和抗逆性，具有較高的實際和理論價值。PEG-6000作為滲透調節劑，已廣泛應用于不同植物的干旱環境模擬方面[6，17-18]。本試驗通過對PEG-6000模擬干旱脅迫下大葉醉魚草種子萌發相關指標及幼苗生理特性進行分析，可以對大葉醉魚草種子和幼苗的抗旱性有初步的了解。

植物種子萌發指標是反映其耐旱性能的最直接指標，本研究結果表明，大葉醉魚草種子能在PEG質量分數為5%的干旱脅迫下正常萌發，發芽率、發芽勢、發芽指數和發芽啟動時間與對照組間無顯著差異;10%PEG脅迫處理下大葉醉魚草的發芽勢和發芽指數雖然顯著低于對照組（P<0.05），但發芽啟動時間和最終發芽率與對照相比無顯著差異;在15%PEG脅迫下所有指標均顯著低于對照組（P<0.05）;而當PEG質量分數為20%時，大葉醉魚草種子萌發受到強烈抑制，質量分數達到25%時已完全致死。

3.2 干旱脅迫對大葉醉魚草幼苗葉片滲透調節物質含量和膜脂過氧化作用的影響

游離脯氨酸作為植物體內重要的滲透調節物質，在植物響應干旱脅迫時大量增加以發揮生理保護作用。植物體內的脯氨酸會在其面對高溫和干旱等逆境脅迫時大量積累，其含量高低可以在一定程度上反映植物遭受干旱脅迫傷害的程度，大葉醉魚草遭受干旱脅迫時體內會積累較多的脯氨酸，且脯氨酸含量與脅迫程度和時間呈正相關，表明大葉醉魚草幼苗隨著干旱脅迫強度的增加，其體內需要產生大量的脯氨酸來應對外界干旱脅迫，與眾多植物干旱脅迫研究的結果[19-20]一致。MDA能通過結合膜上的酶和蛋白質而破壞質膜的完整性，并導致選擇透性喪失，其含量高低可以反映植物受到干旱脅迫傷害程度的大小[21]。本研究中大葉醉魚草幼苗遭受干旱脅迫時，葉片MDA含量顯著增加，細胞膜出現損傷，膜透性降低;而隨著干旱脅迫時間的延長，低濃度、中濃度PEG脅迫下的葉片MDA含量上升不明顯，高濃度PEG脅迫下MDA含量急劇上升，說明大葉醉魚草幼苗可通過生理調節作用調整生理機能以適應一定程度的干旱環境，具有一定的抗干旱能力，然而PEG脅迫強度過大會導致大葉醉魚草幼苗細胞膜出現嚴重損傷，加劇膜脂過氧化程度，導致生理劣變。

3.3 干旱脅迫對大葉醉魚草幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、 POD 和 CAT 普遍存在于植物體內，是植物體內的重要抗氧化酶，與植物的生理生化活動關系密切。干旱或水分脅迫下，上述3種酶可協同起作用，有效清除活性氧及其他過氧化物自由基，緩解外在環境脅迫對植物造成的傷害[22-23]。本研究結果表明，隨著脅迫時間的延長，大葉醉魚草幼苗的SOD、CAT活性均表現為先上升后下降的趨勢，POD活性則在脅迫初期就表現出最強的活性，與相關研究結果[23-24]一致，說明在遭受干旱脅迫時大葉醉魚草幼苗體內抗氧化酶系統能夠通過復雜的協同調控發揮減少活性氧累積的作用，但在嚴重干旱脅迫下活性氧的增加已超過抗氧化酶系統的負荷而對其造成傷害，從而引起酶活性的降低。此外，MDA的積累也會抑制SOD、POD的活性[25]，從而破壞了保護酶系統的功能，促使膜系統受損加重。

3.4 大葉醉魚草抗旱性的綜合評價

植物抗旱性是一個復雜的綜合性狀，它受多因素影響，而各因素之間又相互作用。綜上所述，大葉醉魚草種子具有一定的干旱耐受能力，在輕度干旱環境中可正常萌發，在中度、重度的干旱環境中仍有一定的種子萌發。同時，大葉醉魚草幼苗能通過調節體內的游離脯氨酸和丙二醛含量來抵抗所處干旱環境的傷害，表現出較好的耐性。

大葉醉魚草是速生常綠灌木，其花期長，花量多，具有較高的觀賞價值。在園林應用中，可在其種子萌發和幼苗生長階段給予一定的干旱脅迫以提升其抗旱能力。本研究結果可為揭示大葉醉魚草種子、幼苗適應干旱環境的機制及今后大葉醉魚草的栽培應用和抗性品種選育提供相關科學依據。

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