溫度調控下枯草芽孢桿菌配合酵母對褶皺臂尾輪蟲種群增長的影響

肖佳華 李茹夢 邵力

關鍵詞：枯草芽孢桿菌;褶皺臂尾輪蟲;酵母;溫度調控;種群增長

褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）是海水魚、蝦、蟹等水產幼苗生長發育期間不可或缺的餌料生物，“育好苗先培好蟲”這句行話說明輪蟲培育是育苗產業上不可缺少的關鍵一環。褶皺臂尾輪蟲食性廣泛，生產上主要以投喂單胞藻為主，但土池生產中單胞藻的接種和培育受天氣環境等不可控因素的影響較大，工廠化生產中單胞藻的接種和培育則受場地限制等因素影響較大，因此單胞藻產量極其不穩定，池塘內常常因為出現藻類的快速演替，從而導致輪蟲餌料短缺的問題，嚴重影響育苗產業的經濟效益。在單胞藻缺乏時，酵母是被廣泛運用的輪蟲基礎餌料，20世紀60年代Hirata發現可以用面包酵母培養海水輪蟲[1]，20世紀70年代海水小球藻與面包酵母培養輪蟲的模式被廣泛推廣[2]，相比小球藻，酵母生產廠家眾多，可獲得性好，發酵條件簡單，成本低廉，可在短時間內替代單胞藻作為輪蟲的主要餌料，酵母已經被證實可用于輪蟲高密度生產養殖，可保證在單胞藻供應不足情況下維持輪蟲的存活和生長。但相關研究已經證實單獨用酵母培養的輪蟲，易產生營養缺乏癥狀，如今輪蟲營養強化的研究涉及到藻類和酵母搭配光合細菌、魚油、維生素B12和維生素C等[3-8]，甘松永等用酵母與枯草芽孢桿菌作為輪蟲餌料進行高密度培養，結果證實酵母和芽孢桿菌可用作餌料培養[9]。

本試驗針對枯草芽孢桿菌生長特性及配合酵母投喂后對輪蟲種群生殖的影響作進一步研究，以期獲得枯草芽孢桿菌與酵母搭配的最佳添加濃度和控制溫度，盡可能為實際生產當中所遇到的問題提供數據支持，也為輪蟲營養強化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的準備

本試驗中使用的試驗菌株為枯草芽孢桿菌粉活化后分離篩選得到，經生物性狀和培養試驗鑒定為合格的水產養殖專用枯草芽孢桿菌菌株，枯草芽孢桿菌菌粉購自濟寧金山生物工程有限公司。

本試驗使用的褶皺臂尾輪蟲為鹽城射陽海水育苗基地輪蟲養殖池塘內取塘口底泥休眠卵孵化而來，試驗室孵化后進行單個體純化培養，純化培養后收集休眠卵以保種，輪蟲培養液采用人工海水配方，并每天更換培養液，培養條件：光照度約為 4 000 lx，晝夜比為 16 h ∶ 8 h。

種子培養基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、015%牛肉膏，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

液體培養基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、030% K2HPO3、0.10% 30.8 mg/L MnSO4、0.70% CaCO3、0.05% MgSO4·7H2O、0.01% FeCl3，pH值為7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

斜面培養基：將15 g營養瓊脂溶入1 000 mL液體培養基中，121 ℃滅菌30 min，趁熱倒入已滅菌的培養皿，4 ℃冷藏。

酵母輪蟲基礎食物懸液：取干酵母加入濃度為1.5%葡萄糖培養基，溫度為25 ℃，活化30 min后，以22 ℃、5 500 r/min離心去除葡萄糖培養基，加入人工海水配成濃度為6×106個/mL酵母液備用。高活性干酵母購自安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌活菌生長曲線的測定方法 在無菌操作臺下，將4 ℃保存的斜面培養基菌株接入已滅菌的新斜面培養基中，置于菌種培養箱 37 ℃ 活化24 h后接種到100 mL種子培養基中，37 ℃，200 r/min，搖床振蕩培養24 h。將培養后的種子液按7%的接種量接入已滅菌的100 mL液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養枯草芽孢桿菌母液，培養0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h時對枯草芽孢桿菌進行計數。測定各時間點活菌數量時用1 mL無菌吸管吸取1 mL母液的菌懸液，加入9 mL無菌人工海水混勻成1 ∶ 10稀釋比例的菌懸液，這樣依次稀釋，直至得到1 ∶ 105、1 ∶ 106、1 ∶ 107、1 ∶ 108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010等濃度，每次稀釋更換無菌吸管，以上每個濃度設置3次重復。向每個滅菌培養皿中倒入約10 mL已滅菌的液體培養基，混合均勻，待凝固后備用，用 1 mL 無菌吸管分別吸取不同稀釋濃度活菌懸液 0.1 mL，加至已凝固好的培養基中，用涂布棒涂勻，在無菌操作臺中靜置 30 min 后，倒置于37 ℃的恒溫培養箱內培養18～24 h，對同一梯度平行平板菌落數進行統計，計算平均值，根據稀釋倍數和取樣接種量換算樣品中活菌含量。

1.2.2 輪蟲種群動態研究方法 取冷藏保存的輪蟲休眠卵，放入海水培養液中，在自然光照、25 ℃條件下進行孵化，并于16～24 h內觀察發育狀況，發育形成穩定的群體后，挑取出日齡4 h以內的輪蟲幼體置于一次性細胞培養板（6孔）中，每孔加入 5 mL 試驗溶液，每孔5只輪蟲幼體，每組設置6個平行;在枯草芽孢桿菌剛進入對數生長期的時間點聯合酵母配成試驗溶液，根據預試驗結果，當枯草芽孢桿菌的濃度超過1 000 mg/L時對輪蟲生長開始有抑制作用，設置枯草芽孢桿菌的濃度梯度為0（對照組）、100、200、300、500、800 mg/L，設置培養箱光照度為 4 000 lx，晝夜比為16 h ∶ 8 h，溫度分別設置為 20、25、30 ℃。每次間隔24 h鏡檢并更換培養液，連續觀察10 d，對輪蟲個體數進行計數，統計輪蟲種群數量、日種群增長率以及種群密度等。

1.3 數據處理

種群密度=種群總數/培養體積。種群密度單位為ind./mL。

根據收集的試驗數據，采用Excel作初步處理，再用Sigma Plot 11.0軟件進行處理。根據試驗設計，對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并進行多重比較，結果用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線測定

在培養0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h時對枯草芽孢桿菌活菌數進行記錄，以活菌數量的對數作縱坐標，以培養時間作橫坐標，繪制活性菌株生長曲線，由圖1可知，枯草芽孢桿菌菌株從種子培養基接入液體培養基后經歷了4個生長時期，分別為延遲期、對數生長期、穩定期和衰退期，0～4 h為延遲期，4～10 h進入對數增長期，活菌的數量呈指數型增長，峰值約達到1.1×1010CFU/mL后進入穩定期，穩定期為10～24 h，活菌總體數量基本保持不變，24 h后進入衰退期，活菌數量下降。因此，活化菌的時間應控制在4 h左右，此時菌株剛進入對數生長期，細菌形態典型、生物活性強。

2.2 20 ℃下不同濃度枯草芽孢桿菌聯合酵母對輪蟲種群的影響

2.2.1 20 ℃條件下輪蟲種群動態 20 ℃時，褶皺臂尾輪蟲在不同濃度枯草芽孢桿菌中種群動態變化

見圖2，輪蟲種群數量隨枯草芽孢桿菌的濃度升高先上升再降低。對照組最大種群容納量為 324 ind.，100、200、300、500、800 mg/L枯草芽孢桿菌處理組最大種群容納量分別為343、369、375、402、356 ind.。在種群起始密度均為1.0 ind./mL的情況下，除 300 mg/L 枯草芽孢桿菌處理組在第10天才到達種群數量高峰外，其他各處理組和對照組均在第9天達到種群數量高峰，之后種群數量呈下降趨勢。

2.2.2 20 ℃條件下輪蟲種群增長率 褶皺臂尾輪蟲在20 ℃條件下不同濃度枯草芽孢桿菌日種群增長率見圖3，試驗組種群增長率始終高于對照組，500 mg/L枯草芽孢桿菌試驗處理組在第5天達到各試驗組中最大種群增長率，為16.3%，明顯高于對照組，各組種群增長率均隨時間先上升后下降。對照組在第5天達到峰值，處理組種群增長率峰值出現時間均與對照組一致。

2.2.3 20 ℃條件下輪蟲種群密度 20 ℃時，輪蟲在不同濃度枯草芽孢桿菌中種群密度變化見圖4。第2天，對照組與各試驗處理組種群密度差異較小。第3天，各處理組與對照組相比種群密度顯著增大（P<0.05）。第9天，100、200、800 mg/L處理組與對照組相比，雖然種群密度增大，但差異不顯著（P>0.05）。第10天，種群密度普遍下降，500 mg/L 組種群密度較第9天減小，但與對照組差異保持顯著（P<0.05）。總體來看，在20 ℃條件下，除 300 mg/L 濃度之外，其他濃度組種群密度隨時間先增大后減小。

2.3 25 ℃條件下不同濃度枯草芽孢桿菌聯合酵母對輪蟲種群的影響

2.3.1 25 ℃條件下輪蟲種群動態 25 ℃條件下對照組和試驗組最大種群容納量見圖5，對照組最大種群容納量達到333 ind.，100、200、300、500、800 mg/L枯草芽孢桿菌處理組的最大種群容納量分別達到603、647、723、842、639 ind.。試驗周期內各濃度處理組種群最大容量與對照空白組差異顯著（P<0.05），500 mg/L組最大容納量是空白對照組的2.53倍。除200 mg/L組之外，對照組及其他試驗處理組到達峰值的時間相同，均在試驗第9天。

2.3.2 25 ℃條件下輪蟲種群增長率 25 ℃條件下輪蟲種群增長率見圖6，對照組種群增長率隨時間延長呈先快速上升后緩慢下降的趨勢。100、200、300、800 mg/L處理組種群增長趨勢同對照組，呈先快速增長再緩慢下降的趨勢，4個濃度處理組最大種群增長率均在第3天出現，較對照組提前1 d。第1天至第3天，800 mg/L組種群增長率最高，從第4天開始，500 mg/L種群增長率超越800 mg/L處理組，并保持緩慢增長趨勢，在第7天到達最大種群增長率后開始下降，在第10天，試驗處理組與對照組之間差異顯著（P<0.05），但各試驗組之間種群增長率差異不顯著（P>0.05）。總體而言，25 ℃時添加枯草芽孢桿菌后，種群增長率在試驗周期內始終高于空白對照組，在所有試驗處理組中綜合種群增長率最大的是 500 mg/L 處理組，增速最快的是 800 mg/L 處理組。

2.3.3 25 ℃條件下輪蟲種群密度 由圖7可知，25 ℃時試驗第2天，對照組輪蟲種群密度為（1.2±0.3） ind./mL，與100、200、300、500 mg/L處理組之間差異并不顯著（P>0.05），但此時對照組與最高濃度組之間種群密度差異顯著（P<0.05），最高濃度（800 mg/L）組種群密度達到（1.9±0.4） ind./mL，均大于對照組及其他處理組。試驗第3天，對照組種群密度為（2.1±0.7） ind./mL，100、200、300、500、800 mg/L處理組種群密度分別為（3.1±0.7）、（2.8±0.5）、（3.3±0.6）、（3.0±0.6）、（3.8±0.7） ind./mL，各試驗組均顯著高于對照組（P<0.05）。試驗第9天，500 mg/L處理組種群密度達到峰值，為（28.1±0.4） ind./mL，為對照組濃度的2.55倍，300 mg/L處理組種群密度達到（24.1±2.3） ind./mL，是對照組的2.19倍，此時最高濃度組的種群密度與100、200 mg/L處理組差異不顯著（P>0.05），分別為（21.0±2.0）、（19.9±2.6）、（21.5±2.3） ind./mL，分別較對照組提高93.6%、82.7%、94.5%。試驗第10天，各試驗組種群密度保持穩定， 增速降低。總體而言，在25 ℃溫度條件下，最適添加濃度控制在300～500 mg/L區間內最佳。

2.4 30 ℃時不同濃度枯草芽孢桿菌聯合酵母對輪蟲密度的影響

2.4.1 30 ℃條件下輪蟲種群動態 由圖8可知，30 ℃時， 對照組與100、200、300、500、 800 mg/L處理組的最大種群容納量分別為263、509、513、530、587、488 ind.，各處理組與對照組差異顯著（P<005）。最大種群容納量出現在500 mg/L處理組，其容納量是對照組的2.23倍。試驗組容納量隨枯草芽孢桿菌濃度升高呈先升高后下降趨勢，第10天，800 mg/L試驗組與100 mg/L試驗組差異顯著（P<0.05）。100、200、300、800 mg/L處理組及對照組到達峰值的時間相同，均在試驗第7天，500 mg/L處理組到達峰值的時間為第6天，較其他處理組提前1 d達到容納量峰值。

2.4.2 30 ℃條件下輪蟲種群增長率 由圖9可知，30 ℃條件下，所有組別種群增長率均隨時間延長呈先快速上升后下降。其中300、500 mg/L處理組最大種群增長率出現在第2天，較對照組提前 1 d，其中500 mg/L處理組種群增長率高于 300 mg/L 處理組。對照組與100、200、500 mg/L 處理組的最大種群增長率出現在第3天。在第3天時，800、300 mg/L處理組種群增長率低于空白對照組，其他試驗組均高于空白對照組。種群增長率最大的是500 mg/L處理組。

2.4.3 30 ℃條件下輪蟲種群密度 由圖10可知，30 ℃時，單因素方差分析結果表明，在種群起始密度均等的情況下，第2天時對照組與100、200、300、500 mg/L處理組差異顯著（P<0.05），與800 mg/L處理組差異不顯著，各處理組間種群密度無顯著差異（P>0.05），此時500 mg/L處理組種群密度為（3.6±0.6） ind./mL，較對照組種群密度增加565%。第3天時，500 mg/L處理組與100、200 mg/L 處理組之間差異不顯著（P>0.05），與空白對照組差異顯著（P<0.05）， 300、800 mg/L試驗組保持緩慢增長，與空白對照組差異不顯著，不具有統計學意義（P>0.05）。第4天時，對照組除與 800 mg/L 對照組差異不顯著（P>0.05）外，與100、200、300、500 mg/L處理組均差異顯著。在試驗第6天時，500 mg/L 試驗組種群密度達到所有處理組中最大值，為（19.6±1.0） ind./mL，是此時空白對照組的1.96倍，在第6天后呈下降態勢，其他濃度（100、200、300、800 mg/L）組在第7天達到各自的最大種群密度，分別為（16.9±1.2）、（17.1±0.9）、（17.6±2.0）、（16.2±2.7） ind./mL，較此時對照組種群密度（11.2±1.7） ind./mL 分別上升509%、52.7%、57.1%、44.6%。總體而言，添加枯草芽孢桿菌的處理組最大種群密度均高于空白對照組，在受試濃度范圍內，30 ℃條件下最適添加濃度范圍為300～500 mg/L。

3 討論

針對單胞藻生產不穩定以及藻相突變引起的輪蟲餌料不足等問題，為短時間內穩定輪蟲產量，本試驗對枯草芽孢桿菌配合酵母進行研究。試驗結果表明，在酵母作為主體餌料濃度一定的情況下，溫度和枯草芽孢桿菌濃度是影響褶皺臂尾輪蟲種群數量增長的主要因素。

3.1 枯草芽孢桿菌濃度對褶皺臂尾輪蟲的影響

枯草芽孢桿菌是水體中重要的微生態環境因子之一，在水產養殖生產活動中起著對水體生物殘留物及殘餌分解轉化的調節作用。用酵母培養輪蟲是向水體內添加活酵母來保證輪蟲攝食，在生產中隨著酵母的投喂量增加，單位水體中的有機含量也逐漸增高，所以在輪蟲生長過程中用酵母液培養輪蟲，常常出現殘渣過多水質惡化的問題。酵母培養液中添加一定量枯草芽孢桿菌后，枯草芽孢桿菌可在水體中快速繁殖，同時產生大量的胞外酶類（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等），消耗水體中的生物殘留物，改善水質降低化學需氧量和氨氮水平，同時分解出多種氨基酸和維生素類物質等代謝產物，為輪蟲生長提供可利用的營養物質，對輪蟲種群增長起著促進功能。本試驗的結果顯示，輪蟲酵母培養液中添加枯草芽孢桿菌的效果表現明顯，各溫度條件下，處理組中輪蟲種群最大容納量和密度顯著高于空白對照組。溫度設置在20、25、30 ℃，在枯草芽孢桿菌設置的0～500 mg/L濃度區間內，褶皺臂尾輪蟲的種群數量增長效果明顯。在各個溫度節點之間，當超過一定濃度的時候，設置過高的枯草芽孢桿菌濃度并不利于繼續擴大種群容納量，尤其最高濃度 （800 mg/L） 的生長效果均明顯低于 500 mg/L 試驗組，這與預試驗得出當枯草芽孢桿菌濃度超過 1 000 mg/L 時對褶皺臂尾輪蟲的生長是有明顯抑制作用的結論相符合。根據試驗結果分析，在以酵母液為基礎培養液的情況下，活酵母菌進入水體之后，在水體中的繼續擴大繁殖消耗大量氧氣，當過量的枯草芽孢桿菌加入酵母基礎培養液后則進一步導致水體中氧氣不足，同時枯草芽孢桿菌因為種群繁殖優勢取代酵母菌成為水體優勢種，抑制酵母菌的生長，而枯草芽孢桿菌本身無法作為主體餌料滿足輪蟲生長營養需要，從而直接影響輪蟲攝食生長，嚴重時甚至導致輪蟲在短時間內因濃度和饑餓雙重脅迫而快速死亡。在各溫度條件下，在以活酵母液為主體餌料的情況下，枯草芽孢桿菌最適添加濃度為500 mg/L。

3.2 溫度調控對褶皺臂尾輪蟲的影響

溫度是影響輪蟲種群動態的一個重要影響因子，不同溫度對影響輪蟲的種群動態產生顯著影響[10-12]。本試驗結果顯示，隨著培養溫度的逐漸升高，輪蟲的最大種群增長率出現的時間縮短。說明，提高溫度可以有效地加快輪蟲的繁殖，在一定范圍內繁殖速度與溫度呈正比，這與鄭樂云的試驗結果[13]相符。鄭樂云對超小型輪蟲生長繁殖情況進行研究，結果表明，在25～38 ℃溫度內超小型輪蟲繁殖速度與溫度呈正相關關系，溫度越高，繁殖速度越快[13]。本試驗結果表明，最大種群密度和最大容納量總體表現出隨著溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。在實際生產中為了加快輪蟲繁殖，往往須要設置高溫，但繁殖速度不代表繁殖能力，溫度越高并不代表種群容納量越大，孫迪杰等探究溫度對褶皺臂尾輪蟲壽命與繁殖的影響，結果表明，溫度越高繁殖速度越快，但就繁殖能力而言，輪蟲在高溫區和低溫區區別并不顯著[14]，本試驗結果與之相符。本試驗在以酵母為基礎餌料的情況下，種群容納量在20～30 ℃條件下并非溫度越高越好，原因可能是溫度越接近30 ℃，就越接近2種菌類最適宜的繁殖溫度，在自然生態環境下，藻類通過光合作用可產生溶解氧補充水體中的氧氣，供有機物分解以及水中微生物消耗。而在沒有藻類植物產生光合作用的酵母培養液中，升溫后的枯草芽孢桿菌和酵母菌的快速繁殖會大量消耗氧氣，在沒有采取任何增氧措施的情況下，升高水體溫度后，枯草芽孢桿菌憑借種群繁殖優勢再次成為優勢種，輪蟲在營養液中唯一的飲食來源被限制，在沒有外界藻類持續供應的情況下，升溫導致水體菌群的改變，從而會對輪蟲的生長和攝食產生影響。總體而言，20、25、30 ℃濃度處理組輪蟲最大密度較對照組分別上升24%、153%、74%，若在生產周期內需要在最快速度最短時間內得到足量輪蟲，仍然可盡量將溫度控制在高溫（30 ℃）區，若想得到最大生產潛力，則將溫度適當降低以獲得最大種群容納量。

4 問題與展望

生物餌料高密度生產過程中，輪蟲從投喂小球藻轉移到投喂人工餌料后會大量死亡，其死亡原因與水體中菌落生態系統突變相關，生物餌料對不同菌類的營養需求以及菌類和主要餌料品種的協調作用須要進一步探索與研究。本試驗從宏觀角度證實添加枯草芽孢桿菌能明顯提高輪蟲產量，酵母與枯草芽孢桿菌之間的協同機制尚不明確，從營養強化角度來分析，長時間食用酵母配合枯草芽孢桿菌能否提高輪蟲體內高度不飽和脂肪酸含量還須要進一步檢測。其次，輪蟲高密度養殖過程中，水體中菌落生態較復雜，單一有益菌種想要形成優勢種須要達到一定數量，具有一定的難度，所以如何在大水體環境下確保濃度與活菌數是生產中的關鍵，同時對于菌類繁殖環境的控制也是重點，須要盡可能地營造適合菌種的生長環境，保持養殖水體內溶氧環境，定向培育優勢菌群并發揮其作用，以達到預期的效果。如今在高密度養殖導致水體環境日益惡化的背景下，水產科研人員須要開發出更多益生菌和微生態制劑，向水產行業從業者傳播健康的微生態協調理念，擴大經濟效益和環保效益，促進我國水產育苗行業的健康發展。

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