無患子總皂苷提取工藝優化及其對酪氨酸酶的抑制活性

劉俊宏 邱智東

關鍵詞：無患子;總皂苷;提取工藝;富集工藝;正交試驗;酪氨酸酶;黑色素

無患子產于長江流域以南[1]，《本草綱目》《雞肋篇》均有記載，稱為肥珠子、油珠子[2]。無患子果皮皂苷成分主要為三萜及倍半萜類，具有較強的表面活性作用[3-4]，含量達5.33%[5]?！侗静菥V目》中載：洗頭去風明目，洗面增白祛斑。在現代中藥及天然藥物化學研究中認為，無患子中活性物質可以通過對酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互變酶的作用，抑制黑色素的產生，從而達到美白效果。在這其中，酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵酶，對酪氨酸酶活性的控制，是美白護理的關鍵。近年來雖有報道無患子提取物對酪氨酸酶有抑制作用[6-7]，但對無患子總皂苷提取工藝優化及對酪氨酸酶活性抑制作用鮮有新的報道，本研究擬通過優化無患子總皂苷提取工藝、考察無患子皂苷對酪氨酸酶活性的抑制作用，來評價無患子總皂苷美白護膚的作用效果，為無患子在美白護膚化妝品的工業化生產提供可行性方案。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料

試驗儀器：藥物天平（JYT-2，上海醫用激光儀器廠）;電子天平[AL-204，梅特勒-托利多（上海）有限公司];超聲提取器（SY-360，上海寧商超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（WMZK-72，上海躍進醫療器械廠）;電熱鼓風干燥箱（DHG-9035A，上海源長實驗儀器設備廠）;恒溫水浴鍋（HH-S6，天津先權有限公司）;酶標儀（SpectraMax PLus-384，美谷分子儀（上海）有限公司）旋轉薄膜蒸發儀（R-3001，鄭州長城科工貿有限公司）。

試驗材料：無患子（2018年12月購于海寧市鹽官苗木合作社，產于浙江）由長春中醫藥大學董金香教授鑒定;酪氨酸酶（25 000 mg，Sigma公司）;DOPA（Sigma公司）;磷酸緩沖鹽（北京化工有限公司）;熊果苷標準品（批號：110742-201620，中國藥品生物制品檢定所）。大孔吸附樹脂D101（上海恒遠生物技術發展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 無患子總皂苷提取工藝優化

1.2.1.1 標準曲線建立 精確稱取齊墩果酸標準品12.5 mg，甲醇定容至50 mL，配制成為 0.25 mg/mL 齊墩果酸標準品溶液，待用。分別精確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL配制好的齊墩果酸標準品溶液置于比色皿中，70 ℃下水浴蒸干溶液，將蒸干后各比色皿中分別加入3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 mL 60% H2SO4溶液，充分振蕩，搖勻。將得到溶液于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min，冷卻后靜置15 min，待測。以空白溶液為參比，于520 nm波長處測定各組樣品的吸光度[8-9]。以測得結果的吸光度為縱坐標和對應的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.1.2 單因素考察

1.2.1.2.1 乙醇濃度考察 稱取無患子果皮30 g，料液比為1 g ∶ 10 mL提取時間，為30 min條件下，將乙醇濃度設定為10%、30%、50%、70%、90%，分別進行提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進行總皂苷含量比較。

1.2.1.2.2 提取時間考察 稱取無患子果皮30 g，以10%乙醇為提取溶劑，在35 ℃料液比為 1 g ∶ 10 mL 條件下，將提取時間設定為30、60、90、120、150 min，分別提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進行總皂苷含量比較。

1.2.1.2.3 料液比考察 稱取無患子果皮30 g，以10%乙醇為提取溶劑，在35 ℃提取30 min條件下，將料液比（g ∶ mL）設定為1 ∶ 10、1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 90，分別提取1次，旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏，將所得干膏進行總皂苷含量比較[10-12]。

1.2.2 正交試驗設計 試驗選擇超聲提取法進行無患子總皂苷的提取。按L9（34）正交表進行試驗，選擇提取溶劑濃度、提取時間、料液比為考察因素（表1），選擇無患子總皂苷含量為考察指標設計試驗。

1.2.3 驗證性試驗 按照“1.2.2”節下所得最優提取方案連續提取3次，通過3次總皂苷得率結果，考察最優方案的穩定性。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率測定方法

1.2.4.1 樣品制備 稱量1 000 g無患子果皮粉末，使用所得的最佳工藝提取無患子總皂苷，濃縮提取液，蒸干提取液成干膏，備用。

1.2.4.2 大孔樹脂吸附富集 取3份最優方案提取總提取物，每份取10 g，分別定容至50 mL容量瓶中。準確量取已經預處理的D101大孔樹脂200 mL 3份，濕法裝柱分別標號：Y-1（水-D101）、Y-2、Y-3，分別上樣10 g提取物，依次以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3倍體積量依次洗脫。收集洗脫液，揮干溶劑，制成干膏，分別稱質量，待用[13]。

1.2.4.3 有機試劑萃取 取“1.2.4.1”節下制得總提取物10 g，溶于100 mL蒸餾水中，轉入分液漏斗，依次分別加入100 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（水飽和）萃取，分別收取萃取液及萃取后所得水層，于50 ℃下分別減壓濃縮干燥，制成干膏，稱質量后待用。

1.2.4.4 試驗溶液配制

1.2.4.4.1 供試品溶液配制 取“1.2.4.2”“1.2.4.3”節下制得的干膏各5 mg，用磷酸緩沖液分別定容至5、10、25 mL容量瓶中配成1、0.5、0.25 mg/mL 質量濃度的溶液待用作為供試品溶液。

1.2.4.4.2 陽性對照溶液配制 取熊果苷標準品5 mg，依照“1.2.4.4.1”節方法配制成為1、0.5、025 mg/mL的溶液作為陽性對照待用。

1.2.4.5 檢測方法 精確吸取不同質量濃度試驗溶液、分別依次按照表2將試驗溶液加入于96孔板中A、B、C、D中，置于酶標儀中，并于450 nm處測吸光度，得出不同樣品溶液的抑制率作比較。依據公式計算酪氨酸酶的抑制百分率[14]：抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。

2 結果與分析

2.1 標準曲線建立結果

試驗結果見圖1，按“1.2.1.1”節下方法建立標準曲線，結果顯示：y=0.613x-0.059 5，r2=0.999 1，齊墩果酸在0.125～0.875 mg/mL范圍內，質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 提取工藝條件考察

2.2.1 單因素考察試驗結果 以無患子總皂苷含量為參考指標，分別對影響總皂苷提取率的乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數等試驗因素作為研究對象，按照“1.2.1.2”節下試驗考察上述因素。

2.2.1.1 乙醇濃度對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時提取溶液乙醇濃度對總皂苷得率影響，結果如圖2所示。隨著提取溶劑中乙醇濃度不斷增加，總皂苷得率與乙醇濃度呈正相關，當提取液乙醇濃度高于50%時，總皂苷得率呈下降趨勢，而當乙醇濃度在40%～60%時，總皂苷得率較高且得率較接近，因此，綜合考慮試驗成本，應當考察乙醇濃度為40%、50%、60%時乙醇濃度對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.2.1.2 提取時間對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時提取時間對總皂苷得率影響，結果如圖3所示。隨著提取時間的不斷增加，在0～1.5 h時間范圍內總皂苷提取率與提取時間呈正相關，當提取時間超過15 h時，總皂苷提取率沒有明顯降低，因此，綜合考慮試驗成本，應當考察提取時間為0.5、1.0、1.5 h時，提取時間對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.2.1.3 料液比對無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變，考察無患子果皮提取時料液比對總皂苷得率影響，結果如圖4所示。當料液比為 1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL時總皂苷得率隨提取液增加而提高，呈現這種規律的原因是隨著提取溶劑比例增加，無患子果皮中活性物質逐漸從細胞內部溶出并擴散到溶液中。當料液比為 1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 90 mL時總皂苷得率呈下降趨勢。綜上，考慮到試驗成本及總皂苷提取效果，選擇料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL 時，提取料液比對無患子總皂苷提取得率的影響。

2.3 正交試驗結果

試驗結果（表3、表4）表明，在正交試驗結果表（表3）中 RA>RC>RB，因此，無患子總皂苷提取率影響因素從大到小依次為：溶劑濃度>料液比>提取時間，根據直觀分析對于A因素提取溶劑濃度 k3>k2>k1;對于B因素提取時間k3>k1>k2;對于C因素料液比k3>k2>k1;可得出最佳提取工藝為A3B3C1，即：以60%乙醇為提取溶劑，提取時間 1.5 h，料液比1 g ∶ 30 mL進行提取。

2.4 驗證試驗

對篩選后的提取工藝進行3次驗證試驗， 提取率分別為8.76%、8.71%、8.89%，RSD值為106%，表明本試驗確定的提取工藝穩定、可行。

2.5 對酪氨酸酶的抑制活性

由表5可以看出，2種不同富集方式總皂苷得率不同，各組分得膏率順序如下：水飽和正丁醇得膏率>Y-3（70%乙醇）>H2O>Y-1（水-D101）>Y-2（30%乙醇）>乙酸乙酯>石油醚，在考察各個樣品體外對酪氨酸酶抑制活性時，不同富集方式得到的樣品抑制率有顯著不同，如表6所示，在初始質量濃度（0.25 mg/mL）下，各樣品抑制率較接近，無明顯區別，在中間質量濃度（0.5 mg/mL）下，較其他樣品，熊果苷對酪氨酸酶抑制作用最強，其抑制率為46.77%，石油醚次之，其抑制率為4482%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率為4462%，在高質量濃度（1 mg/mL） 時，各樣品對酪氨酸酶抑制活性基本與中間濃度時表現一致，其中熊果苷對酪氨酸酶抑制作用最強，其抑制率為84.69%，石油醚次之，其抑制率為81.25%，Y-3（70%乙醇）稍差，其抑制率為8022%。但石油醚得率較低，考慮成本問題，D101大孔樹脂富集法70%乙醇洗脫更經濟實用，綜上，無患子果皮提取物表現出較強的酪氨酸酶抑制活性，因此，可作為美白產品添加劑，綜合考察得膏率及抑制率，通過大孔樹脂D101，70%乙醇洗脫后得到總皂苷對酪氨酸酶活性抑制效果最好，因此，可選此工藝為無患子總皂苷富集工藝。

3 討論與結論

酪氨酸酶在人體皮膚黑色素生成系列反應中具有重要的生理功能，抑制酪氨酸酶活性可以阻斷人體皮膚黑色素形成，從而起到美白皮膚的效果，本試驗以天然藥物無患子為研究對象，優化無患子總皂苷提取、富集工藝并合理評價無患子總皂苷的體外酪氨酸酶抑制效果。

在無患子提取工藝研究中，分別對影響無患子總皂苷提取得率的因素：乙醇濃度、提取時間、料液比進行單因素考察試驗，并以無患子總皂苷得率為參考指標，通過正交設計優化得到無患子總皂苷提取工藝為：提取溶劑為60%乙醇，提取時間為 1.5 h，料液比為1 g ∶ 30 mL，經試驗驗證此方法穩定可靠。

本試驗不僅對無患子總皂苷提取工藝進行優化，還進一步考察了無患子提取物體外酪氨酸酶抑制活性。為提高無患子提取物的應用效率，又分別對無患子提取物進行2種純化方式下的得膏率和酪氨酸酶活性抑制作用的考察。水飽和正丁醇組得膏率相對較高，為43.12%，但其對酪氨酸酶抑制活性相對較差，因此不選作較優的富集方案;石油醚層組分雖相同質量濃度下對酪氨酸酶抑制活性與熊果苷接近，但由于其得膏率較低，不作選擇，考慮到成本問題遂選擇無患子提取物通過大孔樹脂D101、70%乙醇洗脫方法對無患子提取物進行富集純化。純化后無患子總皂苷提取物利用效率更高，對酪氨酸酶抑制活性更強，能更好地發揮無患子的美白功效。

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