GA和BA激素調(diào)控對馬鈴薯雜交結實的影響

李佩華，楊亞輝，彭正松，蔡光澤，方志榮

(西昌學院, 四川 涼山 615013)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一，其營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高、適應性強，發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對于國家糧食安全具有重要意義[1]，為此我國提出了馬鈴薯主糧化。隨著戰(zhàn)略不斷推進，馬鈴薯種質(zhì)資源的需求更加多元化，因此對育種工作提出了更高的要求。【前人研究進展】我國的馬鈴薯育種工作可追溯到上世紀，育種既有品種間雜交、誘變育種及芽變育種等傳統(tǒng)方式，也有新起的航天育種、分子標記輔助育種及細胞工程技術育種等新方式，但四倍體栽培種間的雜交仍是主要的育種方式[2-4]。品種間雜交是通過收獲馬鈴薯雜交產(chǎn)生的漿果，對漿果中的實生籽進行育苗，后進行選育的技術[5]。但馬鈴薯為典型的自花授粉作物,雜交的結實率較低[6]，其雜交結實除受父母本品種特性的影響外，還受外界氣象條件和雜交技術的影響[7]。為此，許多學者提出了采用優(yōu)質(zhì)種薯、應用氣霧栽培法、搭架法、重復授粉、抱磚法、套麥稈法、施用化學藥劑等方法來提高馬鈴薯結實率[8-12]。此前已有師理[13]、白小娟[14]、謝婉[15]等學者發(fā)現(xiàn)運用植物激素GA和BA能促進馬鈴薯的開花結實。【本研究切入點】本試驗主要通過在孕蕾期對馬鈴薯母本噴施GA3和6-BA，輔助以套麥稈和搭架技術，研究各激素組合混合噴施對馬鈴薯雜交結實的影響。【擬解決的關鍵問題】旨在為馬鈴薯田間雜交育種提供一定技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：米拉、烏洋芋、南13-15、涼薯97優(yōu)質(zhì)種薯若干(西昌學院馬鈴薯課題組提供)。

試驗試劑：醋酸洋紅溶液(天津蘭翼生物科技有限公司)、藍墨水(上海精細文化用品有限公司)、氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(上海博微生物有限公司)、GA3(杭州木木生物科技有限公司)、6-BA(杭州木木生物科技有限公司)。

試驗器材：FA2204N電子天平(上海菁華科技儀器有限公司)、Nikon ECLIPSE80生物顯微鏡(株式會社尼康)、剪刀、鑷子、鉛筆、MITIR溫濕度計(溫州市米特爾智能科技有限公司)、網(wǎng)袋、園藝標簽掛牌。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計及田間種植 本試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，每個雜交組合共設置5個激素處理組合以及1個清水對照(表1)，3次重復。每小區(qū)起4壟，壟距1 m，每壟播2行，株距0.35 m，小區(qū)寬4 m，長7 m，小區(qū)面積28 m2。小區(qū)內(nèi)不開溝，區(qū)組間及四周開0.5 m深溝，四周設保護行，試驗面積575 m2，另外選取水肥均勻的地塊種植父本100 m2，一個雜交組合試驗面積為675 m2，總試驗面積為2025 m2。

1.2.2 父母本的選擇 馬鈴薯存在天然不育性，對雜交結實有很大影響，故父母本的選擇十分重要。胚乳平衡數(shù)假說提出，每個種都存在一個有效的倍性，在種間雜交時，胚乳中母本與父本的比例必須是2∶1，只有這個比例才能雜交成功[16]。除此之外，馬鈴薯雜交母本宜選擇本地適應性強并存在自然結實率較高的材料，父本宜選擇花粉活力較高與且與母本存在性狀差異的材料[17]。依據(jù)課題組多年對64份優(yōu)良材料的田間觀察記錄，本次試驗選擇的雜交組合為：①米拉(♀)×烏洋芋(♂)，②南13-15(♀)×米拉(♂)，③涼薯97(♀)×烏洋芋(♂)。父母本主要性狀見表2。

1.2.3 父本花粉活力測定 父本花粉活力測定對馬鈴薯雜交具有重要意義,據(jù)馬鈴薯父本選擇的研究可知花粉活力高于50 %適合做父本[18]。馬鈴薯花粉實驗于下午5：00-6:00采集父本花粉，將其分別放入裝有冰袋的泡沫箱帶回實驗室。先進行干燥處理，再裝在PCR管中在-20 ℃條件下保存花粉[19]。后分別用醋酸洋紅染色法、藍墨水染色法-和氯化三苯基四氮唑(TTC)法[20-22]3種方法對花粉進行活力測定，在顯微鏡下觀察，不僅要統(tǒng)計花粉的活力，而且還要觀察花粉粒的飽滿度。

1.2.4 雜交技術 雜交育種能有效的提高馬鈴薯種質(zhì)資源的開發(fā)，而馬鈴薯雜交結實不僅受本身遺傳的限制，而且受外界溫濕度影響大，據(jù)研究可知在溫度18～23 ℃、濕度80 %～90 %時雜交結實率較高[23]，故試驗選在早上8:00-10:00進行雜交操作。同時由于試驗雜交時間較長，為避免人為及天氣變化因素對試驗結果的影響，故在雜交操作時每一區(qū)組由1人完成，為保證足夠的雜交花朵數(shù)，可分多天進行。

具體步驟[24]如下。整理花序：用剪刀對母本花枝進行整枝處理，將已經(jīng)開過、未開以及發(fā)育不良的花朵剪去，一株馬鈴薯留2～4朵花。授粉：花粉采取現(xiàn)采現(xiàn)用的方式，取父本花粉抖落在大拇指指甲蓋上，然后讓其接觸雌蕊柱頭，不能讓花粉混雜。套麥稈：麥稈剪成2～3 cm長度，麥稈要比雌蕊長，將其套在已授粉的雌蕊上，這樣可以免去雄，減少對母本花朵的傷害，從而提高雜交結實。套袋：寫上父母本和日期，對雜交的花序掛牌，雜交成功后雜交漿果長到1cm左右就可以進行套袋操作，用網(wǎng)袋套上雜交果，以避免自然掉落。

表1 處理編號

表2 父母本主要性狀

1.2.5 田間管理 在雜交期間，將溫濕度計置于田間，測定試驗地的溫度和濕度，從而選擇適宜的溫度濕度范圍進行雜交操作，雜交前可適時澆水，以保證土壤的濕度以及降低環(huán)境溫度。到馬鈴薯苗長到一定高度時，對雜交馬鈴薯母本采取壟內(nèi)搭架措施，增加通風透光，減少馬鈴薯苗倒伏情況，以便于后期雜交操作。將植物激素處理組合濃度配置好后，1∶1的配比混合，在現(xiàn)蕾初期對母本馬鈴薯的頂部進行噴施。同時為保證馬鈴薯漿果正常成熟，應當注意防治晚疫病，在馬鈴薯晚疫病發(fā)生初期或始花期應用銀法利藥劑(68.75 %氟菌·霜霉威)進行噴施，以及防治害蟲啃食漿果。

2 結果與分析

2.1 開花影響

馬鈴薯的開花與結實有著密切的聯(lián)系，通過在馬鈴薯孕蕾期使用GA和BA植物激素的調(diào)控能促進開花繁茂，開花數(shù)量多，除此之外，使用植物激素還能夠延長馬鈴薯花期，可以使花期延長到30 d以上，從而使父母本花期相遇，促進馬鈴薯的雜交結實。

2.2 花粉活力

由圖1可知，使用醋酸洋紅染色法、藍墨水染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC) 法3種方法測定的花粉活力存在一定差異。烏洋芋采用醋酸洋紅染色法測定的花粉活力較高，米拉采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定的花粉活力較高，但3種方法測定的結果都高于50 %，說明烏洋芋與米拉適合做父本。

2.3 雜交結實率

對各雜交組合的試驗結果進行方差分析可知，米拉(♀)×烏洋芋(♂)、南13-15(♀)×米拉(♂)及涼薯97(♀)×烏洋芋(♂)的處理間F值分別為42.690、28.272、52.356均大于F0.01(5，10)=5.64，說明3種雜交組合的各處理間處理效果差異均達到了極顯著水平，還需進一步進行多重比較。采用最短顯著極差法(SSR法)進行多重比較，各雜交組合的處理結實率多重比較結果見表4。

表3 父母本開花習性

2.3.1 米拉(♀)×烏洋芋(♂)的雜交結實率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3處理組合的雜交結實率最高，達到了71.57 %，調(diào)控效果明顯，噴施清水對照組的結實率平均值最低，只有19.57 %。各激素組合處理的結實率高低為：20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥50mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥噴施清水CK。由字母標記結果可知，在5 %的顯著水平與1 %極顯著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素組合與另外5種激素組合的處理效果差異顯著。

2.3.2 南13-15(♀)×米拉(♂)的雜交結實率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3處理組合的雜交結實率最高，達到了54.11 %，調(diào)控效果較明顯，噴施清水對照組的結實率平均值最低，只有16.73 %。各激素組合處理的結實率高低為：20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥50 mg/L GA3﹥噴施清水CK。由字母標記結果可知，在5 %的顯著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素組合與另外5種激素組合的處理效果差異顯著，在1 %的極顯著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素組合與10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3效果差異差異不顯著，與其他的激素組合處理效果差異極顯著。

2.3.3 涼薯97(♀)×烏洋芋(♂)的雜交結實率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3處理組合的雜交結實率最高，達到了68.43 %，調(diào)控效果明顯，噴施清水對照組的結實率平均值最低，只有18.20 %。各激素組合處理的結實率高低為：20mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥50 mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥噴施清水CK。由字母標記結果可知，由字母標記結果可知，在5 %的顯著水平與1 %極顯著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素組合與另外5種激素組合的處理效果差異顯著。

圖1 父本花粉活力Fig.1 Paternal pollen vigor

表4 結實率多重比較結果

注：小寫字母表示5 %顯著水平，大寫字母表示1 %極顯著水平。

2.4 千粒重

待漿果成熟(果實發(fā)黃發(fā)亮具有清香味)后適時收獲，放置于通風陰涼處，使其完成后熟。待雜交果變軟后將實生籽洗出，放置通風干燥處晾干，稱量千粒重。然后將標明各雜交組合的實生籽分別放入紙袋中進行存放。從表5可知，同一雜交組合的千粒重相差不顯著，只有不同雜交組合間存在千粒重的差異，不同處理下雜交組合的千粒重差別不顯著。

3 討 論

3.1 環(huán)境因素的影響

馬鈴薯為長日照作物, 涼山州因有得天獨厚的自然環(huán)境, 譽為全國最佳馬鈴薯種植區(qū)域之一，孕育出許多獨特的馬鈴薯品種資源[25]，普格縣五道箐鄉(xiāng)屬于典型高二半山區(qū)，常年日照充足，因此在高海拔地區(qū)馬鈴薯結實率一般比低海拔地區(qū)高，長時間光照能有效促進馬鈴薯的植株生長和有性生殖過程，促進開花坐果，減少花的脫落，增加開花數(shù)量和提高花粉活力。除此之外，溫度、濕度的控制與馬鈴薯雜交結實密切相關，在溫度、濕度適宜的條件下能顯著提高馬鈴薯雜交的結實率。如果溫度低于18 ℃，花芽可能不分化，也可能形成花芽但不開花，高于25 ℃時，馬鈴薯花粉母細胞可能會死亡，導致花粉的育性降低[26]，過于干燥，花粉難以粘在雌蕊上，雜交不易成功，故需要實時測定田間的溫度濕度，選擇適宜的時間或采取控溫控濕技術措施，以提高雜交成功率。

表5 不同處理的雜交組合千粒重平均值

Table 5 The average 1000-grain weight of hybrid combinations with different treatment (g)

3.2 不同雜交組合的影響

馬鈴薯雜交組合的選擇對育種影響很大[27]，不同雜交組合的結實能力差異比較大。在本試驗中20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3處理使馬鈴薯雜交結實率達到最高，但不同雜交組合的結實率高低不同，植物激素的處理對不同雜交組合的影響不一致，雜交結實率與雜交組合的選擇有關。親本的選育為馬鈴薯雜交結實提供依據(jù)，馬鈴薯一些不同品種的開花特性存在很大的差異，許多親本存在天然的雄性不育、花粉敗育以及胚乳敗育，造成結實率極其低，在選擇時父本則需要花粉量大，花粉活力高的，母本則需要天然結實性好的，而且需要親本組合花期相近以及親和力高，從而促進馬鈴薯雜交的結實率。在選擇雜交組合時，亦可以引進原始栽培種、新型栽培種以及野生栽培種[28]，選擇出優(yōu)良親本用于雜交育種，提高種質(zhì)資源的利用開發(fā)。

3.3 雜交操作的影響

雜交操作的熟練度對馬鈴薯雜交結實有重要的意義。要求操作人員熟練和仔細，要了解馬鈴薯的花器構造，在整個雜交過程都需要小心，仔細取父本的花粉在指甲蓋上，輕輕地將大拇指指甲蓋與母本雌蕊接觸，為避免花粉混合，每次重新取粉時，需要用紙將指甲擦拭干凈，在授粉后用準備好的麥稈套住雌蕊，防治雨水的沖刷，而且可以不用去除雜交花朵的雄蕊，減少操作的失誤性，從而促進馬鈴薯雜交的結實。本試驗與其他雜交試驗的套袋不同，是在結果以后再進行套網(wǎng)袋操作，防止雜交果脫落。

3.4 植物激素的影響

植物激素的處理能有效促進馬鈴薯開花，有效防止花柄節(jié)離層的產(chǎn)生，提高雜交結實率。BA的主要生理作用為促進開花，增加坐果率以及促進果實的生長[29]，BA能夠有效延長馬鈴薯的開花時間，從而促進雜交父母本的花期相遇。GA的主要生理作用為：抑制地下塊莖形成, 從而改變地上部與地下部的營養(yǎng)分配，促進花序發(fā)育，增加開花結實能力[30]。GA能誘導單性結實，形成無籽果實，試驗結果未出現(xiàn)這種現(xiàn)象，均為有籽果實，但試驗沒有計算單果產(chǎn)籽量以及單果產(chǎn)籽粒，以及沒有進行實生籽的萌發(fā)試驗，無法詳細解釋植物激素GA對實生籽的影響。植物激素的使用都是有嚴格的范圍控制，過多會有抑制作用，所以在使用植物激素時，一定要把握好濃度。根據(jù)試驗結果顯示，GA和BA混合使用時的雜交結實率比單獨使用的高，但促進馬鈴薯雜交開花結實能力到底是GA還是BA單獨使用更好，還需要進一步驗證。在蒙蕊學的研究中，沒有使用植物激素的處理，雜交結實率最高僅有29 %[31]，而在本次試驗中，馬鈴薯最高雜交結實率達到71.57 %。

4 結 論

通過選擇優(yōu)良的父母本、改善田間管理措施、選擇適宜的溫濕度進行雜交操作以及進行植物激素的處理，使馬鈴薯雜交結實率得到極大的提高，能使米拉(♀)×烏洋芋(♂)的雜交結實率達到71.54 %、南13-15(♀)×米拉(♂)的雜交結實率達到54.11 %、涼薯97(♀)×烏洋芋(♂)的雜交結實率達到63.29 %，雖然不同的雜交組合結實率有差異，在馬鈴薯孕蕾期使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3處理馬鈴薯頂部，試驗效果最佳，能明顯促進開花，并且延長花期，顯著提高馬鈴薯的雜交結實率。