彩葉楊樹葉片中花色素苷的光保護作用

朱秀紅，楊金橘，溫道遠，韓曉雪，茹廣欣

(河南農業大學林學院，河南 鄭州 450000)

【研究意義】中華紅葉楊是首個由黑楊2025雄株芽變產生的彩葉楊樹品種，推向市場以來彩葉楊樹品種的豐富度與觀賞度不斷提高，以其色彩的繽紛斑斕，極強的適應能力以及較快的生長周期廣受喜愛，而花色素苷作為彩葉植物成色的關鍵因素，研究不同品種彩葉楊樹花色苷合成機制及其在不同環境脅迫下對葉片保護作用的調控機理，對促進我國進一步豐富以花色素苷呈色為基礎的彩葉樹品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】花色素苷不止可以為植物提供豐富多彩的顏色，已有研究還證明作為多酚類物質的花色素苷能夠以其特殊結構減弱光照脅迫引起的過量ROS產生，對葉片起到一定的光保護作用[1-2]?！颈狙芯壳腥朦c】通過研究光照脅迫期間及恢復后5個彩葉楊樹品種的花色素苷含量、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、葉黃素循環、最大光化學效率(Fv/Fm)及相關酶活性和非酶抗氧化劑活性等指標的差異，以探究葉色變化對于植物葉片光能的吸收與利用造成的影響，證明高光脅迫引起的花色素苷含量與積累與相關抗氧化酶活性，葉內ROS以及非酶抗氧化劑活性(DPPH自由基清除能力)的相互關系?！緮M解決的關鍵問題】深入研究過剩光能誘導花色素苷的合成機制，以期為彩葉楊樹的廣泛栽培和應用提供進一步理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

在新密試驗田中，選取長勢良好的全紅楊、中紅楊、金紅楊、紅霞楊與翡翠楊的一年生苗木同側枝剪下帶回進行扦插培養(每個品種每株重復扦插3盆)，幼苗生長至25 cm(包括頂芽，主枝生3～4片葉 )放置于溫室內，溫度為15～25 ℃，每天遮光10 h繼續培養，確?？扇⌒迈r樣品進行重復試驗。

試驗以常溫常光(CK)為對照(溫度為 25/15 ℃，光照強度為 200 μmol·m-2·s-1)，用高光脅迫(溫度為 25/15 ℃，光照強度為500 μmol·m-2·s-1)連續處理3 d，每天進行取樣測定，3 d后將受脅迫后樣本材料放置于智能溫室內進行適當遮陰處理恢復光照，在恢復的2 d進行取樣測定。

1.2 試驗方法

采用張憲政提出的丙酮乙醇萃取法[3]進行葉綠素與類胡蘿卜素含量測定。采用何奕昆[4]，于曉南[5]等的鹽酸甲醇分光光度計方法，進行花色素苷的測定。分別取5種彩葉楊樹頂芽向下第2片葉進行葉黃素各組分含量的測定。采用THAYER等[6]的方法用高效液相色譜法測定。葉黃素循環的脫環氧化程度用(A+Z)/(V+A+Z)表示。用便攜式脈沖調制熒光儀FMS22測定5種彩葉楊樹葉片的初始葉綠素熒光(Fo)及暗適應下的最大葉綠素熒光(Fm)，用Fv/Fm表示PSII的最大光化學效率值，其中Fv由(Fm-Fo)計算所得[7]。用過氧化氫紫外分光光度法[8]測定過氧化氫酶(CAT)的活性；用愈創木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[8]；用 NBT(氮藍四唑)光化學還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用趙世杰等改進紫外吸收法測定抗壞血酸還原酶(APX)活性[9]；采用De Gara L 等提出的磷酸緩沖法進行DHAR活性測定[10]。H2O2含量采用劉俊等(2000)的離心標準曲線方法[11]。超氧離子產生速率采用王愛國等的方法[12]。DPPH測定采用張宏梅等改進的紫外分光光度法[13]。

1.3 數據分析

采用Origin9.0與Excel2016軟件對實驗數據進行統計與分析，并用單因素方差分析來檢驗樣本間的差異顯著性(置信區間為95 %)。本文中的折線圖以及柱狀圖均為平均值，標準差為誤差線。

2 結果與分析

2.1 Fv/Fm和ROS在高光脅迫下的變化

在脅迫開始的第1天，5個彩葉楊樹品種的最大光化學效率(Fv/Fm)差異并不顯著，在0.65～0.75范圍內(圖1)。隨著高光脅迫處理的時間(天數)增長，5個品種的Fv/Fm均開始下降，即在葉片內都發生了光抑制現象。且根據圖1可知，翡翠楊(綠葉品種)的Fv/Fm值下降最快，全紅楊的Fv/Fm值變化幅度最小，中紅楊、金紅楊與紅霞楊的下降幅度介于兩者之間。在脅迫開始的第3天，全紅楊的Fv/Fm值最高，是翡翠楊的1.63倍。進行光照恢復后，5個品種的Fv/Fm逐漸上升，光照恢復第1天，全紅楊的最大光化學效率已恢復至脅迫初始水平，其余4個品種均上升至略低于初始水平。光照恢復后的第2天，全紅楊和中紅楊的Fv/Fm值上升到略高于原始水平，翡翠楊的Fv/Fm值恢復到脅迫初始值的85 %，金紅楊和紅霞楊恢復至與初始水平相當。表明5個品種中，全紅楊對高光脅迫有較強的抵御作用，能更好的對光照脅迫做出應答。而翡翠楊的最大光化學效率(Fv/Fm)隨光照強度變化顯著，在高光脅迫時葉片內遭受了更強烈的光系統破壞。

圖1 高光脅迫下5個彩葉楊樹品種的最大光化學效率變化Fig.1 Changes in Fv/Fm in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

圖2 高光脅迫下5個彩葉楊樹品種的H2O2含量(A)和產生速率(B)變化Fig.2 Changes in H2O2 content and production rate in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

2.2 色素含量在高光脅迫下的變化

表1 高光脅迫下5個品種的彩葉楊樹的花色素苷、葉綠素及類胡蘿卜素含量變化

續表1 Continued table 1

色素含量Pigment content脅迫時間Stress time全紅楊Populus ×euramericana ‘quanhong’中紅楊Populus ×euramericana ‘zhonghong’金紅楊Populus ×euramericana ‘jinhong’紅霞楊Populus ×euramericana ‘hongxia’翡翠楊Populus ×euramericana ‘feicui’30.743±0.0903b0.424±0.1377c0.424±0.0691c0.586±0.0495bc1.374±0.0747a40.657±0.0554c0.341±0.0563b0.406±0.0852a0.341±0.1202c1.012±0.0694b50.723±0.0406a0.328±0.0448bc0.433±0.1017b0.272±0.1039c0.443±0.0382bCK3.207±0.0877a2.761±0.1353b2.529±0.1153 b2.686±0.1518b2.167±0.1181 c葉綠素含量(mg/g)Chlorophyll content13.004±0.0266a2.524±0.0548bc2.402±0.0798c2.579±0.0803b2.405±0.1013c22.757±0.1633a2.286±0.0694b2.257±0.0511b2.401±0.0849a2.689±0.1545a32.467±0.1191b2.049±0.0590c2.121±0.0799c2.337±0.1026b2.972±0.1474a42.414±0.1064a1.957±0.0710b2.004±0.0785b2.002±0.0972c2.514±0.1167b52.401±0.1149a1.935±0.0502b1.973±0.0894b1.907±0.0763b1.848±0.1339bCK0.712±0.0180a0.663±0.0502ab0.595±0.0407c0.612±0.0271bc0.501±0.0219d類胡蘿卜素含量(mg/g)Carotenoid content10.792±0.0376a0.707±0.0132b0.622±0.0131c0.649±0.0108c0.556±0.0554d20.813±0.0164a0.725±0.0066b0.701±0.0101b0.727±0.0098b0.611±0.0816c30.845±0.0286ab0.796±0.0115ab0.735±0.0076c0.784±0.0061bc0.665±0.0584d40.701±0.0197c0.671±0.0113ab0.554±0.0104c0.635±0.0079b0.581±0.0562c50.619±0.0157a0.589±0.0106ab0.546±0.0085b0.565±0.0082ab0.477±0.0699c

在對照組中，全紅楊的花色素苷含量是翡翠楊的11.72倍(表1)，進行光照脅迫后，5個品種的花色素苷含量均顯著增加，但翡翠楊的花色素苷含量變化幅度的相較于其余4個品種小，脅迫后的第3天，全紅楊的花色素苷含量增加至翡翠楊的26.21倍。恢復2 d后，翡翠楊的花色素苷含量降至與對照水平相當，中紅楊的花色素苷含量下降至對照水平的4.30倍，金紅楊與紅霞楊恢復后下降至對照水平的3倍左右，全紅楊維持了脅迫誘導后積累的大部分花色素苷。

5個品種的葉綠素a與葉綠素b含量在對照組中差異不顯著，進行脅迫的第1天，全紅楊葉綠素a含量是翡翠楊的1.3倍，中紅楊，金紅楊與紅霞楊的葉綠素a含量維持在1.82～1.94 mg/g范圍內，差異并不顯著。進行光照脅迫后，5個品種的葉綠素a含量均呈不明顯的下降趨勢。進行恢復的第2天，翡翠楊的葉綠素a含量下降至1.40 mg/g，其余4個品種均維持在1.60 mg/g左右。全紅楊，中紅楊，金紅楊與紅霞楊的葉綠素b含量在脅迫后同樣呈不顯著的下降趨勢，而值得注意的是翡翠楊的葉綠素b含量在高光脅迫過程中卻出現緩慢上升，在脅迫的第3天，葉綠素b含量上升至對照水平的2.65倍；恢復光照后，翡翠楊的葉綠素b含量開始下降，恢復的第2天下降至對照的85.50 %。葉綠素含量與組成成分的比值是衡量植物光捕獲能力的標準之一，雖然5個彩葉楊樹品種的花色素苷含量差異顯著，但光捕獲能力在遭受高光脅迫及恢復后并未出現顯著差異。

圖3 高光脅迫下5個彩葉楊樹品種的葉黃素循環庫(C)和脫環氧化程度(D)Fig.2 Changes in xanthophyll pool size(V+A+Z) and de-epoxidation state[(A+Z)/(V+A+Z)]in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

5個品種的類胡蘿卜素含量在光照恢復后與對照水平基本一致，但高光脅迫期間使5個品種的類胡蘿卜素出現了不同程度的下降，全紅楊在脅迫后與恢復后都具有較高的類胡蘿卜素含量。

2.3 葉黃素變化

葉黃素循環可以表現植物的熱耗散效率，對熱能的耗散使植物具有一定的光保護作用。從圖3可以看出，高光脅迫對全紅楊的葉黃素庫容量(V+A+Z)沒有顯著影響(C)，其余4個品種在光照脅迫下呈上升趨勢，其中翡翠楊的葉黃素庫容量(V+A+Z)上升幅度最大。光照恢復后5個品種的葉黃素庫容量(V+A+Z)均下降至對照水平。從圖3(D)可以知道，高光脅迫對5個品種的葉黃素脫環氧化程度(A+Z)/(V+A+Z)影響較為顯著，進行脅迫3 d后，翡翠楊的(A+Z)/(V+A+Z)上升至對照的1.67倍，全紅楊和中紅楊的(A+Z)/(V+A+Z)的變化幅度略小，增長1.45倍左右，金紅楊和紅霞楊的增幅均為1.5倍左右。即在高光脅迫下，5個品種的葉黃素脫環氧化增長程度類似，進行光照恢復后，5個品種均恢復至略高于對照水平，其中翡翠楊的葉黃素脫環氧化程度在光照恢復后保持在對照值的1.33倍。綜合對比可以知道，雖然翡翠楊的(A+Z)/(V+A+Z)值高于其余4個品種，但全紅楊在具有較高的葉黃素脫環氧化程度的同時，其葉黃素庫容量(V+A+Z)高于翡翠楊，因此全紅楊具有較高的熱耗散效率。

2.4 抗氧化劑和抗氧化酶活性變化

從圖4可以看出，全紅楊的DPPH清除能力在脅迫前最高，隨著光照脅迫時間的延長顯著增加，恢復階段維持平緩下降。中紅楊、金紅楊和紅霞楊的DPPH清除能力依次下降，在脅迫下的增加幅度也依次減小，恢復2 d后能維持最初水平。翡翠楊的DPPH清除能力相比于其他4個品種較低，且在整個脅迫階段和恢復階段都沒有顯著變化。說明，全紅楊，中紅楊等紅葉品種具有較高的非酶抗氧化劑活力，對其光保護能力有較大貢獻，而翡翠楊的非酶抗氧化劑活力較低。

圖4 高光脅迫下5個彩葉楊樹品種的非酶抗氧化劑DPPH清除能力Fig.4 Changes in radical scavenging activities in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

由圖4與表1的對比可得，隨著花色素苷含量的增加，5個品種的DPPH活性也不斷上升。表明在高光脅迫與光照恢復階段，基于DPPH的自由基清除能力與花色素苷含量密切相關，花色素苷存在下，葉片的光保護能力主要表現為對非酶抗氧化劑的促進作用。

在對照組中(脅迫前)，5個品種的SOD、POD、CAT和APX 4種抗氧化酶活性差異并不顯著(圖5-E，F，G，I)，脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的差異較為明顯(圖4-H)。高光脅迫使5個品種的彩葉楊樹葉片內的5種抗氧化酶活性有不同程度的提高。全紅楊與翡翠楊的SOD，POD活性相當，在進行光照脅迫后，兩者的酶活性增加幅度也相同，但光照恢復以后，翡翠楊的POD維持在對照水平的171.24 %，而全紅楊下降至對照的76 %，其余3個品種在光照恢復后均下降至對照水平。

翡翠楊的過氧化氫酶(CAT)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)在高光脅迫下的增加幅度基本相同，其增幅與含量均顯著高于全紅楊。中紅楊，金紅楊和紅霞楊CAT和DHAR活性介于2個品種之間，且在光照恢復后都恢復至對照水平。值得注意的是，與其余4個品種相比，翡翠楊的抗壞血酸過氧化物酶(APX)在脅迫后顯著上升，且在恢復光照強度后仍維持了較高APX含量，而其余4個品種的APX活性隨著光照強度的減弱下降至對照水平。

綜合圖4～5可以知道，全紅楊紅葉品種對高光脅迫的良好應答機制主要歸功于較高的非酶抗氧化劑活力(DPPH自由基清除能力)，而抗氧化酶并未對其光照保護能力表現出突出貢獻。翡翠楊(綠葉品種)對高光脅迫的應答機制主要依靠抗氧化酶含量及活性的增強。

3 結論與討論

3.1 高光脅迫誘導產生的過剩光能

與對照組相比，維持相同溫度條件下，光照強度增強導致5個品種彩葉楊樹的Fv/Fm值明顯下降，表明葉片的最大光化學效率下降，光系統的反應中心遭到損傷[14-15]。

圖5 高光脅迫下5個彩葉楊樹品種的抗氧化酶活性變化Fig.5 Changes in antioxidant enzyme activities in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

3.2 高光脅迫下花色素苷的產生與積累

3.3 花色素苷在彩葉楊樹中的光保護作用

Chalker-Scott L在花色素苷對環境脅迫的響應一文中已討論，出現環境脅迫時(例如本文中利用高光脅迫)，植物在各組織中會積累一定的花色素苷[25]，這為花色素苷與葉片光保護作用之間存在密切關系提供了證據。且后有研究已報道，遭受低溫及光照等非生物脅迫后均可以導致花色素苷的進一步合成，同時增加積累量[26-27]。本文中，光照脅迫下花色素苷的大量合成與積累以及各抗氧化酶活性和非酶抗氧化劑活性的顯著變化，均證明高光脅迫下花色素苷含量越高的品種對葉片的光保護能力越強。同時，進行光照脅迫后，5個品種的葉綠素含量及組成比例變化未出現明顯變動，即它們的光捕獲能力在遭受高光脅迫及恢復后并未出現顯著差異。側面說明，葉片此時出現的光保護作用并非來自光捕獲能力的貢獻，而主要源自于花色素苷的大量合成與積累，這為彩葉楊樹中含有花色素苷含量更多的品種具有更強的光保護能力提供了進一步證明。