芥子堿和硫酸銅對芥子堿降解菌酶活力的影響

余 丹，黃小麗，鄧 卉，馮 楊，李 斌，鄒成義 ，屈 東

(1.四川省畜牧科學研究院飼料研究所，四川 成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 成都 611130)

【研究意義】芥子堿是以菜籽粕為代表的十字花科類飼料資源的重要次生代謝產(chǎn)物[1]，易被動物腸道微生物降解為腥味物質(zhì)，誘發(fā)畜禽的魚腥味綜合征，嚴重影響畜產(chǎn)品品質(zhì)和人類健康[2]；它味道苦澀，是脫除了硫甙的菜籽產(chǎn)品適口性較差的主要原因，嚴重影響動物采食量[3]；它可與蛋白質(zhì)結合降低蛋白質(zhì)的消化吸收率[4]；芥子堿的抗雄激素活性能抑制精子成熟，引起動物生殖功能障礙[5]。隨著雙低菜籽粕的推廣和應用，以芥子堿為代表的多酚類物質(zhì)已成為菜籽粕最主要的抗營養(yǎng)因子[6]。因此，探索和研究芥子堿的降解和消減技術，不僅有利于十字花科類地方特色飼料資源的開發(fā)和利用，更有利于減少我國飼料工業(yè)對大豆粕等大宗飼料原料的依存度，為我國飼料工業(yè)穩(wěn)定發(fā)展做出貢獻。【前人研究進展】利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶蛋白降解芥子堿，是目前解決芥子堿抗營養(yǎng)問題最有效最安全的方法[7]。降解芥子堿的微生物包括真菌和細菌[8-9]。相對于真菌而言，細菌基因簡單，新陳代謝旺盛，培養(yǎng)條件要求不高，能夠在較短時間內(nèi)進行大量繁殖，更有利于商業(yè)化生產(chǎn)。【本研究切入點】本項目組近年來專注于芥子堿及其降解菌的研究，通過以芥子堿為唯一碳源的培養(yǎng)基，已成功篩選出了一些芥子堿降解效率較高的微生物[10]，同時發(fā)現(xiàn)，這些微生物對芥子堿的降解可能與一些含銅酶有關。但是，經(jīng)種屬鑒定和安全性評價發(fā)現(xiàn)，部分菌種屬于條件性致病菌，不能直接應用于生產(chǎn)[11-12]。【擬解決的關鍵問題】本試驗擬通過研究芥子堿、硫酸銅以及培養(yǎng)時間對項目組前期篩選出的一株芥子堿降解優(yōu)勢菌 (Sinapine-degrading Bacteria 1,SDB1)相關酶活力的影響，初步確定SDB1中可能參與芥子堿降解的酶類以及影響酶活的因素，旨在為進一步的應用研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 芥子堿降解菌 芥子堿降解菌(SDB1)是四川省畜牧科學研究院畜禽飼料資源開發(fā)項目組前期以芥子堿為唯一碳源，分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢菌，為肺炎克雷伯氏菌屬。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑包括：芥子堿硫氰酸鹽(購自成都德思特生物技術有限公司，芥子堿含量為80 %)；β-葡萄糖苷酶活性測定試劑盒(A031)、脂肪酶活性測定試劑盒(A054)、淀粉酶活性測定試劑盒(C016)、多酚氧化酶活性測定試劑盒(A136)和膽堿酯酶活性測定試劑盒(A023)均購自南京建成生物工程研究所；漆酶活性測試盒(BC1635)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 芥子堿降解菌的富集培養(yǎng)

使用平板劃線法，于優(yōu)化的腦心浸液瓊脂(BHI)培養(yǎng)基中復蘇培養(yǎng)SDB1。培養(yǎng)溫度27 ℃，培養(yǎng)時間12 h。培養(yǎng)基組成:牛腦200.0 g,牛心浸出汁250.0 g,胰蛋白胨、葡萄糖和酵母提取物適量,NaCl5.0 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.8～7.2。

1.3 試驗設計

從SDB1富集培養(yǎng)基中挑取單個菌落接種于SDB1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。產(chǎn)酶培養(yǎng)基共分為1個對照組和4個處理組，每組4個重復。對照組培養(yǎng)基組成為：NaNO33.0 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO40.01 g；胰蛋白胨和蔗糖適量；水 1000 mL。第1組和第2組是分別在基礎培養(yǎng)基中添加0.50和1.00 g/L的芥子堿硫氰酸鹽(折算成芥子堿分別為0.40和0.80 g/L)，第3組和第4組為分別在基礎培養(yǎng)基中添加1.00和3.00 mM/L的五水硫酸銅(表2)。培養(yǎng)基配置好后，調(diào)整pH至7.0～7.5，并將每組培養(yǎng)基分裝至4個500 mL錐形瓶中(250 mL/瓶)作為4個重復，置于27 ℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。

表1 試驗設計

1.4 菌液收集及處理

取培養(yǎng)第2，4，6，8天的培養(yǎng)液各30 mL菌液，在3000 r/min的條件下離心5～10 min，移除上清液(盡量去除干凈)，加入PBS液10 mL，使細菌充分重懸于PBS液中。在4 ℃、12 000 r/min的條件下高速離心15 min，收集離心后的上清液，將上清液保存于-20 ℃冰箱中。

1.5 SDB1酶活性鑒定

參照β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶、漆酶、多酚氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性測試盒操作說明書進行相關酶活力測定。

1.6 統(tǒng)計學分析

結果用平均數(shù)±標準差表述，用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS v.20.0，IBM Corp.，Armonk，New York，USA)對數(shù)據(jù)進行方差分析，用t檢驗對處理組與對照組之間的差異進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 芥子堿和硫酸銅對SDB1淀粉酶活力的影響

由表2可知，SDB1具有一定的淀粉酶活性。與對照組相比，添加0.40 g/L芥子堿，在培養(yǎng)的第2、4、6天，淀粉酶活力均沒有顯著變化，而在培養(yǎng)到第8天時，淀粉酶的活力卻顯著高于對照組，是對照組的2.32倍(P<0.05)；添加0.80 g/L芥子堿對SDB1淀粉酶活力沒有顯著影響，但在培養(yǎng)的第4、6、8天，淀粉酶活力均有提高的趨勢。此外，添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1淀粉酶活力均沒有顯著影響，但培養(yǎng)到第4天時2個組的SDB1淀粉酶活力均有增加的趨勢。

2.2 芥子堿和硫酸銅對SDB1多酚氧化酶活力的影響

由表3可知，SDB1具有多酚氧化酶活性。盡管與對照組相比，添加0.40 g/L芥子堿對SDB1多酚氧化酶活力沒有顯著影響，但數(shù)值上，多酚氧化酶活力有隨培養(yǎng)時間延長而提高的趨勢；添加0.80 g/L芥子堿在培養(yǎng)的第2和4天，多酚氧化酶活性極顯著高于對照組，分別比對照組增加了75.70 %(P<0.01)和197.03 %(P<0.01)。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1多酚氧化酶活力均沒有顯著影響。

2.3 芥子堿和硫酸銅對SDB1β-葡萄糖苷酶活力的影響

由表4可知，SDB1幾乎不具有β-葡萄糖苷酶活性。與對照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿對SDB1β-葡萄糖苷酶活力均沒有顯著影響。添加1.00和 3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1中β-葡萄糖苷酶活力均沒有影響。

19.緊扣重要時間節(jié)點開展集中宣傳。鼓勵探索重要節(jié)點開展法治宣傳的新模式，充分利用“4·26”知識產(chǎn)權日、憲法宣傳周等時間點，選取民營企業(yè)關注的法律法規(guī)或法律熱點問題，集中開展大型的普法宣傳活動，借助重要節(jié)點影響力進一步提升普法效果，提高工作覆蓋面，傳播法律知識，弘揚法治精神。

表2 芥子堿和硫酸銅對SDB1淀粉酶活力的影響

注：同行肩注無*表示不顯著(P>0.05)，有*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，有**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，下同。

Notes：In the same row, values with no asterisk superscripts mean no significant difference (P>0.05)between the control group and the treatment groups, while with one asterisk(*) superscripts mean significant difference (P<0.05) between the control group and the treatment groups, and with two asterisk (**) superscripts mean very significant difference (P<0.01) between the control group and the treatment groups. The same as below.

表3 芥子堿和硫酸銅對SDB1多酚氧化酶活力的影響

表4 芥子堿和硫酸銅對SDB1β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.4 芥子堿和硫酸銅對SDB1漆酶活力的影響

由表5可知，SDB1具有較高的漆酶活性，且漆酶活性隨培養(yǎng)時間延長而增加。與對照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿均可以提高SDB1漆酶活力，其中添加0.40 g/L的芥子堿，在培養(yǎng)第4天，SDB1漆酶活力極顯著提高，是對照組的6.25倍(P<0.01)；添加0.80 g/L的芥子堿，漆酶活力在培養(yǎng)第4和6天均極顯著提高，在培養(yǎng)的第8天也顯著提高，分別為對照組的5.92倍(P<0.01)、3.03倍(P<0.01)和5.70倍(P<0.05)。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1漆酶活力均沒有顯著影響。

2.5 芥子堿和硫酸銅對SDB1乙酰膽堿酯酶活力的影響

由表6可知，SDB1具有一定的乙酰膽堿酯酶活性。與對照組相比，添加0.40 g/L的芥子堿對SDB1乙酰膽堿酯酶活力沒有影響；添加0.80 g/L的芥子堿，乙酰膽堿酯酶的活性在培養(yǎng)第6天時顯著降低，其余培養(yǎng)時間沒有顯著變化。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1乙酰膽堿酯酶活力沒有顯著影響。

2.6 芥子堿和硫酸銅對SDB1脂肪酶活力的影響

由表7可知，SDB1具有一定的脂肪酶活性。與對照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿以及1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對SDB1脂肪酶活力均沒有顯著影響。

3 討 論

芥子堿是芥子酸與膽堿形成的酯類化合物，其化學名稱為4-羥基-3,5二甲氧基苯丙烯膽堿酯。從分子結構看，芥子堿的降解有3個潛在的活性位點：酯基、苯環(huán)上的酚羥基和碳碳雙鍵。酯鍵可以直接水解為芥子酸和膽堿；酚羥基可能發(fā)生氧化反應形成醛酮或者醌類物質(zhì)，雙鍵也可能發(fā)生環(huán)氧化反應[13]。近年來，芥子堿的微生物降解研究主要集中在真菌上：肖翼[14]用米曲霉固態(tài)發(fā)酵法有效脫除了菜籽粕中的芥子堿和多酚。Lacki[15-16]用白腐真菌有效降解了菜粕芥子堿的含量。Rozan[17]采用少孢根霉也成功降解了菜籽粕30 %的酚類物質(zhì)。周浩宇[8]用釀酒酵母、納豆芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌B4混合發(fā)酵菜籽餅粕，使菜籽粕中的芥子堿降解率達到80.06 %。而鈕琰星[13]指出釀酒酵母無論是液態(tài)發(fā)酵還是固態(tài)發(fā)酵都對菜籽粕芥子堿含量沒有顯著影響。本試驗采用的SDB1為項目組前期分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢菌，與項目組前期報道的芥子堿降解菌均為肺炎克雷伯氏菌屬[10]，具有顯著的芥子堿降解效果。與前人報道不同的是，SDB1屬于細菌類微生物。與真菌相比，細菌基因簡單，新陳代謝旺盛，培養(yǎng)條件要求不高，能夠在較短時間內(nèi)進行大量繁殖，具有潛在的優(yōu)勢。

表5 芥子堿和硫酸銅對SDB1漆酶活力的影響

表6 芥子堿和硫酸銅對SDB1乙酰膽堿酯酶活力的影響

表7 芥子堿和硫酸銅對SDB1脂肪酶活力的影響

微生物降解芥子堿的實質(zhì)是其分泌的生物酶對芥子堿的降解。目前研究較多的酶包括多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶、單寧酸酶、阿魏酸酯酶、β-葡萄糖苷酶和脂肪酶等[18-20]。多酚氧化酶是自然界中分布極廣的一類氧化還原酶，是目前已知的可以有效降解芥子堿的主要酶系。Lacki指出白腐真菌分泌的多酚氧化酶可以有效降解芥子堿，其降解效果與溫度、pH和氧氣濃度有關。用相同的酶降解芥子酸也會出現(xiàn)類似的結果[15-16]，說明多酚氧化酶對芥子堿的作用位點可能在芥子堿中芥子酸的部分。本試驗對照組多酚氧化酶活力在數(shù)值上隨培養(yǎng)時間延長而提高，說明SDB1具有多酚氧化酶活性。添加0.40 g/L芥子堿的后，盡管多酚氧化酶活力與對照組相比沒有顯著差異，但是在數(shù)值上提高的趨勢明顯，到培養(yǎng)的第8天時，已經(jīng)達到對照組的2.11倍。而當芥子堿的添加量達到0.80 g/L時，多酚氧化酶的活性在培養(yǎng)的第4和6天極顯著高于對照組(P<0.01)，說明芥子堿作為底物充分激活了SDB1的多酚氧化酶。作為一種銅依賴性蛋白，多酚氧化酶活性受銅離子影響較大，但本試驗添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅，對SDB1多酚氧化酶活性卻沒有顯著影響，原因有待進一步研究。

微生物來源的多酚氧化酶主要是漆酶和酪氨酸酶[21]。漆酶是多酚氧化酶中作用底物最廣的一類。Hu研究了固態(tài)發(fā)酵過程中的漆酶活性和芥子堿的含量，發(fā)現(xiàn)漆酶的產(chǎn)生對芥子堿含量的降低具有顯著作用[22]。微生物漆酶按來源分為真菌漆酶和細菌漆酶[23]。真菌漆酶廣泛存在于多孔菌、脈孢菌、曲霉菌等真菌屬中, 其中擔子菌中的白腐菌漆酶研究最多[24]。鈕琰星[13]的研究指出來源于云芝菌的漆酶對菜籽粕芥子堿具有顯著的酶解作用，且漆酶的反應活性位點是苯環(huán)的酚羥基。細菌漆酶研究不如真菌漆酶深入，目前的報道以芽孢桿菌屬為主，生脂固氮螺菌、鏈霉菌、大腸桿菌等細菌中也發(fā)現(xiàn)過漆酶活性[25]。與真菌漆酶相比，細菌漆酶可能具有更多的優(yōu)點, 如它具有Cu2+抗性[26]、不需糖基化、熱穩(wěn)定性好[27]、最適pH值范圍廣[28]等。因此, 細菌漆酶的應用前景更為廣闊。本試驗采用的SDB1就屬于細菌類微生物，試驗結果顯示：對照組漆酶活力在數(shù)值上隨培養(yǎng)時間延長而提高，第8天的漆酶活力為第2天的2.65倍，說明SDB1具有較強的漆酶活性。該結果也為細菌漆酶驗證了一位新成員。添加0.40或0.80 g/L芥子堿后，SDB1的漆酶活力在培養(yǎng)的第4天到第8天內(nèi)顯著或極顯著高于與對照組(P<0.01)，說明芥子堿作為底物充分激活了SDB1的漆酶。與多酚氧化酶相同，漆酶是一類典型含銅糖蛋白，銅離子是其催化反應的活性中心，因此其活性還會受銅離子含量直接影響。范晶晶[29]研究指出在培養(yǎng)基中添加0.50～4.00 mmol/L硫酸銅，均能提高SYBC starX菌(為Kocuria菌屬)的漆酶活性，其中最適Cu2+濃度為3.00 mmol/L。但是本試驗在培養(yǎng)基中添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅后，SDB1漆酶活力卻沒有增加。目前研究較多的細菌漆酶是CotA蛋白，它來源于芽孢桿菌。汪春蕾證實CotA存在于芽孢桿菌的芽孢壁[30]，是一種銅依賴性蛋白[31]。Matthias將CotA蛋白在大腸桿菌中異源表達發(fā)現(xiàn)，除了胞內(nèi)銅離子濃度外，適宜的銅伴侶也是影響銅離子嵌入CotA蛋白分子并影響CotA活性的重要因素[32]。本試驗中硫酸銅沒有增加漆酶和多酚氧化酶活性是否也與沒有響應的銅伴侶有關，目前還不清楚，需要進一步的研究。盡管芽孢桿菌漆酶是目前細菌漆酶的典型代表，但由于漆酶一般存在于芽孢桿菌的芽孢壁中，提取成本較高，在生產(chǎn)中應用受限，因此篩選具有胞外產(chǎn)漆酶能力強的細菌，對于細菌漆酶的應用具有十分重要的意義。本試驗的SDB1漆酶就是一種胞外細菌漆酶，在推廣應用上具有很大優(yōu)勢。

何江[20]的研究結果表明，β-葡萄糖苷酶和脂肪酶也參與菜籽粕芥子堿的降解，只是降解效果不如漆酶和多酚氧化酶。周浩宇[19]指出釀酒酵母中的β-葡萄糖苷酶可以降解17.65 %的菜籽粕芥子堿。本試驗也研究了芥子堿和硫酸銅對SDB1的β-葡萄糖苷酶和脂肪酶的活性。結果對照組SDB1不具有β-葡萄糖苷酶活性，具有一定的脂肪酶活性。添加芥子堿和硫酸銅沒有顯著改變SDB1的β-葡萄糖苷酶和脂肪酶活性。由于現(xiàn)有大多數(shù)研究都是用菜籽粕替代芥子堿，僅僅是通過測定發(fā)酵前后菜籽粕芥子堿的含量變化來推測酶與芥子堿的關系，并沒有考慮菜籽粕復雜的物質(zhì)組成可能對酶活性和芥子堿含量產(chǎn)生的影響；而本試驗是直接采用的芥子堿硫氰酸鹽(含量達80 %以上)，這可能是導致本試驗結果與現(xiàn)有研究出現(xiàn)差異的原因之一。關于芥子堿與β-葡萄糖苷酶以及脂肪酶的關系目前報道極少，以上推測有待進一步驗證。

項目組前期的抑菌圈定性試驗表明研究[10]表明：與SDB1同種屬的YD-1和YD-2均具有淀粉酶活性。本試驗也進一步考察了SDB1的淀粉酶活性，并研究了芥子堿和硫酸銅對淀粉酶活性的影響。結果SDB1具有一定的淀粉酶活性。添加0.40 g/L芥子堿，SDB1淀粉酶的活力在培養(yǎng)到第8天時顯著高于對照組；添加0.80 g/L芥子堿也有提高淀粉酶活力的趨勢。添加硫酸銅對SDB1淀粉酶活力沒有顯著影響。目前還未見其它關于芥子堿與淀粉酶活力關系的研究報道。結合本試驗脂肪酶和淀粉酶的結果可以設想，當SDB1用于消減十字花科類飼料資源中的芥子堿時，還有可能在一定程度上改善碳水化合物和脂類養(yǎng)分的消化利用率，從而多方面改善飼料品質(zhì)。

4 結 論

(1) 本試驗條件下，SDB1具有一定的淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶的活性，不具有β-葡萄糖苷酶的活性。

(2)本試驗條件下，培養(yǎng)基中添加芥子堿，可以在培養(yǎng)的4～8 d內(nèi)不同程度的提高SDB1淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶活性；芥子堿添加量越高，多酚氧化酶和漆酶活力越高；添加芥子堿對SDB1的β-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、脂肪酶活性沒有顯著影響。

(3) 本試驗條件下，培養(yǎng)基中添加硫酸銅對SDB1的淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶活性均沒有顯著影響。