玉米根際土壤微生物群落結構及多樣性季節變化特征

楊澤良，李萍芳，薛 濤，向書琴，向國紅

(1.湖南科技學院農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000；2. 湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410128)

【研究意義】作為人類直接的生存載體，陸地生態的變化將產生重大的影響，直接影響著人類及其他動植物的生存環境，制約著人類生存生活[1-3]。森林、土壤、微生物等作為陸地生態的重要組成部分，各自發揮著不可或缺的角色。作為植被種植的載體[4-6]，土壤的存在能夠將養分源源不斷地向植被輸送，維持著植被整個生長發育各個階段，在此過程中也離不開微生物的作用，在微生物的參與之下[7-8]，有機質等被分解為可供吸收利用的能量，提升了土壤養分，同時降低了土壤板結等問題的發生，微生物活動也能夠增強土壤孔隙度，同時參與土壤礦化等，成為土壤生化循環的重要組分部分[9]，可以說，在整個能量轉化過程中，微生物起著積極作用，對于改善根際土壤質量作用尤為關鍵。植被能量的獲取離不開發達的根系，因此根際土壤顯得尤為關鍵，直接制約著根系對養分及水分的利用，這也是土壤與植被的緊密結合區，也是微生物活躍的區域，三者共同構成了植被生長發育的關鍵場所，制約著能量交換和物質循環，對于根際土壤而言，根系分泌物能夠顯著影響之，對于微生物及植被交互作用起著直接制約效應，二者的協同發展會形成良好的互惠發展，充分滿足各自所需。一方面，根際土壤的養分條件受到微生物及根系的雙重制約，另一方面，土壤理化特點也受到二者的制約，同時，植被生長發育也會對根際微生物群落分布產生重要影響效果[10]；對于植被生長而言，其不僅離不開土壤養分及水分的供應，也離不開根際微生物的分解及降解作用，其菌類PGPR在促進養分轉化方面的效果尤為顯著，同時對于植被適應性的增強起著積極作用，加強了植被對干旱等逆境的耐受性[11-12]。【前人研究進展】由于根際所處位置具有獨特性，因此其作用也尤為關鍵，直接制約著植被對于養分等能量的吸收利用，更是與微生物交互作用的場所，是吸收能量的載體[6-8]，此外，其分泌物對于微生物活動也起著較顯著的作用，能夠影響根際土壤質量，反哺于植被生長發育，開展根際及土壤等方面的研究具有重要的現實意義。國內對于這方面的研究相對來說起步較晚，可追溯至20世紀80年代，前期的研究主要集中在農作物及林木等方面，隨著研究的不斷深入，根際養分及微生物研究不斷增多，并取得了較為豐碩的研究成果，同時對于分泌物及簇根等方面開展了相關分析，但是對于油料作物的相關研究并不多見[13-14]。【本研究切入點】基于此，本研究開展此方面的相關研究，并將玉米作為探究對象，對于玉米研究而言，以往常注重育種及栽培等方面的分析，對于根際土壤特性的變化并未進行充分的大量研究，對于其根際微生物活動等探究也相對較少，尤其的季節變化下的根際土壤，這對于玉米養分獲取及結實等方面起著明晰的制約效果，對于強化玉米種植具有顯著的現實意義，同時能夠強化土壤相關研究。【擬解決的關鍵問題】因此本研究立足于玉米的不同生長季節，從而一方面探究其根際土壤養分及其理化特征，另一方面對根際微生物特性加以分析，從而促進玉米種植，強化土壤保護，促進玉米的產業化種植，同時對根際土壤的養分特點進行比較，以尋求更為適宜的養分利用方法，注重土壤利用策略，加強土壤保護，促進玉米的合理種植和土壤的有序保護，以提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

將玉米種植區作為研究對象，使用先玉335，并于2018年2月開始正式的實驗分析，并進行根際土壤的采樣，后續對之開展相應的指標分析，由于其花期利于微生物活動，此時開展土樣采集及測樣較為合適；在土樣采集過程中注重土樣的混合均勻，以便于準確進行指標分析，具體來說通過抖根法進行，之后將之在4 ℃下的實驗室溫度保持，在正式的指標測定前將其分為兩個部分，其中部分采樣風干后測定，另一部分直接進行相應的DNA測序。

1.2 研究方法

分別于2、7、10、12月的中旬開展植株取樣，相當于在不同的季節進行了隨機取樣，數量為30株，然后進行根際土樣采集，首先將完整根系及其周邊土壤挖出，接下來將其中不含根系的大塊土壤抖落，之后才借助于小刀將周邊土壤取出，這是非根際土S，為了進行試驗對比，需要將之置于密封袋保存，并進行充分的混合；而根際土樣需通過刷子取樣，也就是附著在根圍5 mm范圍內的土壤，這就是根際土R，在此過程中注意根系的保護，同時去除土樣的雜物以及根系等，這樣區分根際土的情況下共獲取土樣60份，并在4 ℃的常溫下保存，以便于后續開展相應的指標測定。正式測量各項指標前需要進行過篩處理，同時對理化特征加以分析記錄。

1.3 樣品測定

對于樣品的具體測定方法如下：對于pH值、有機碳SOC、全氮STN的測定分別借助于pH測量計、容重法及硝化法進行；通過P4電導儀測定電導率，并通過其估算含鹽量；對于磷、速效氮的測定分別借助于比色法、光度計法[15]。

1.4 土壤總DNA提取

對于土壤DNA的提取，本研究需要依賴于DNA試劑盒開展，在此過程中還需要進行洗脫處理，待其體積為50 μl的情況下，將1 %的瓊脂糖凝膠融入其中，同時利用電泳條帶特性開展相應的質量測定，利用ND-1000光度計進行濃度分析。

1.5 土壤微生物基因組DNA的提取

為了進行基因指標提取，首先需要在溶液中加入根際土樣，并混合均勻，取樣1 mL進行離心處理30 s，并在無菌狀況下進行，溫度不超過5 ℃，待上清液去除后將DNA基因組予以提取。

1.6 DNA擴增及測序

為了完成細菌的擴增測量，需要進行兩輪的操作，尤其要注意V3～V4區；首先，在barcode通用引物的參與下，能夠進行第一輪的擴增處理，尤其是要注重引物的結合，對于引物而言，要求上游達到341F，而下游為805R；對于真菌而言，要求18S rDNA，分別在NS1、Fung條件下進行；在此過程中共進行了5個循環，反應體系及模板分別達到30 μl、20 ng。

從二輪擴增的角度來看，主要集中在PCR產物的橋式引物，此過程中開展5次循環，要求達到5 min的延伸處理，溫度在72 ℃，同時及時將相關的產物回收，在此過程中做好數據記錄及結果記錄分析，最后還需要進行產物混合，并測序高通量。

1.7 數據分析

在開展測序分析的過程中，對于其接頭序列需要去除，同時將堿基拼接后降非特異擴增造成的制約剔除，從而獲取有效序列，作為其數據源，將97 %作為分析闞值；此外，坐標也會和群落分布密切相關，對其相似性加以比較。

2 結果與分析

2.1 不同季節玉米根際與非根際土壤理化性質

由圖1可知，不同季節玉米根際與非根際土壤理化性質隨季節變化趨勢一致，玉米根際、非根際土壤電導率隨季節呈先增加后降低趨勢，大致表現為夏季>秋季>春季>冬季，以夏季根際、非根際土壤電導率達到最大，玉米根際和非根際土壤電導率在不同季節差異均顯著(P<0.05)，夏季、秋季和冬季玉米根際土壤電導率極顯著高于非根際土壤(P<0.01)，春季玉米根際土壤電導率則顯著高于非根際土壤電導率(P<0.05)。由春季到冬季，玉米根際、非根際pH值呈先降低后增加趨勢，大致表現為春季>冬季>秋季>夏季，以夏季玉米根際、非根際土壤pH值最低，其中玉米根際土壤pH值在不同季節差異均顯著(P<0.05)，非根際土壤pH值夏季顯著低于其他季節(P<0.05)；不同季節玉米根際土壤pH值極顯著低于非根際土壤pH值(P<0.01)。

2.2 不同季節玉米根際與非根際土壤養分含量

由圖2可知，不同季節玉米根際與非根際土壤養分含量隨季節變化趨勢相一致，由春季到冬季，玉米根際、非根際養分含量均呈先增加后降低趨勢，以夏季玉米根際、非根際土壤養分含量最高，冬季玉米根際、非根際土壤養分含量最低，并有所波動。其中玉米根際、非根際土壤有機碳含量在不同季節差異均顯著(P<0.05)，并且夏季、秋季和冬季玉米根際土壤有機碳含量極顯著高于非根際土壤(P<0.01)，春季玉米根際土壤有機碳含量則顯著高于非根際(P<0.05)。玉米根際、非根際土壤全氮含量在不同季節差異均顯著(P<0.05)，并且夏季、秋季和冬季玉米根際土壤全氮極顯著高于非根際土壤(P<0.01)，春季玉米根際土壤全氮含量則顯著高于非根際(P<0.05)。玉米根際、非根際土壤全磷含量在不同季節差異均不顯著(P>0.05)，并且夏季、秋季和冬季玉米根際土壤全磷含量與非根際土壤全磷含量差異不顯著(P>0.05)，春季玉米根際土壤全磷含量則顯著高于非根際(P<0.05)。玉米根際、非根際土壤全鉀含量在不同季節差異均顯著(P<0.05)，并且夏季、秋季和冬季玉米根際土壤全鉀極顯著高于非根際土壤(P<0.01)，春季玉米根際土壤全鉀含量則顯著高于非根際(P<0.05)。

“*”“**”分別表示同一季節不同處理間在0.05、0.01水平上差異顯著；不同季節同一處理間不同大寫字母表示不同季節玉米根際土壤在0.01水平上差異顯著。下圖同‘*’ and ‘**’ mean that the difference between different treatments in the same season is significant at the level of 0.05 and 0.01, respectively.Different capital letters in the same treatment in different seasons indicated that the difference of maize rhizosphere soil at 0.01 level was significant in different seasons.The same as below圖1 不同季節玉米根際與非根際土壤理化性質Fig.1 Physicochemical properties of maize rhizosphere and non-rhizosphere soil in different seasons

圖2 不同季節玉米根際與非根際土壤養分含量Fig.2 Soil nutrient contents in rhizosphere and non-rhizosphere of maize in different seasons

表1 玉米根際與非根際土壤細菌多樣性

2.3 不同季節玉米根際與非根際土壤微生物群落多樣性

由表1可知，對于土壤細菌多樣性，不同季節玉米根際與非根際土壤細菌覆蓋度、豐富度指數、Shannon-Wiener 指數、均勻度Evenness、ACE、Chao 1指數、Simpson指數隨季節變化趨勢相一致，由春季到冬季，玉米根際、非根際土壤細菌多樣性指數均呈先增加后降低趨勢，以夏季玉米根際、非根際土壤細菌多樣性指數最高，冬季玉米根際、非根際土壤細菌多樣性指數最低，并有所波動。玉米根際土壤細菌覆蓋度、豐富度指數、Shannon-Wiener 指數、ACE、Chao 1指數均顯著高于非根際(P<0.05)，而根際土壤均勻度Evenness和Simpson指數與非根際差異不顯著(P>0.05)。

由表2可知，對于土壤真菌多樣性，不同季節玉米根際與非根際土壤細菌覆蓋度、豐富度指數、Shannon-Wiener 指數、均勻度Evenness、ACE、Chao 1指數、Simpson指數隨季節變化趨勢相一致，由春季到冬季，玉米根際、非根際土壤真菌多樣性指數均呈先增加后降低趨勢，以夏季玉米根際、非根際土壤真菌多樣性指數最高，冬季玉米根際、非根際土壤真菌多樣性指數最低，并有所波動。玉米根際土壤真菌覆蓋度、豐富度指數、均勻度Evenness、Shannon-Wiener 指數、ACE、Chao 1指數均顯著高于非根際(P<0.05)，而根際土壤Simpson指數與非根際差異不顯著(P>0.05)。

表2 玉米根際與非根際土壤真菌多樣性

圖3 不同季節玉米根際與非根際土壤細菌群落組成Fig.3 Composition of rhizosphere and non-rhizosphere soil bacterial community in different seasons

2.4 不同季節玉米根際與非根際土壤微生物群落組成

由圖3可知，不同季節玉米根際與非根際土壤細菌群落結構隨季節變化趨勢相一致，細菌群落組成沒有發生較大變化，其中玉米根際土壤細菌群落中，優勢類群主要是變形菌門(33.26 %～37.268 %)、酸桿菌門(25.03 %～27.03 %)和芽單胞菌門(8.16 %～11.26 %)，還包括浮霉菌門(3.15 %～6.78 %)、放線菌門(2.15 %～5.19 %)、擬桿菌門(1.96 %～2.15 %)、后壁菌門(2.58 %～4.69 %)、綠彎菌門(5.36 %～8.96 %)、疣微菌門(2.15 %～4.58 %)。非根際土壤細菌群落中，優勢類群主要是變形菌門(45.32 %～49.25 %)、酸桿菌門(18.95 %～23.17 %)和芽單胞菌門(11.05 %～13.05 %)。其中根際土壤細菌酸桿菌門相對豐度高于非根際，變形菌門相對豐度低于非根際。

由圖4可知，不同季節玉米根際與非根際土壤細菌群落結構隨季節變化趨勢相一致，細菌群落組成沒有發生較大變化，其中玉米根際土壤真菌群落中，優勢類群主要是子囊菌門(52.69 %～54.69 %)和擔子菌門(23.04 %～26.17 %)，還包括結合菌門(3.26 %～6.12 %)、壺菌門(0.51 %～1.56 %)、新麗鞭毛菌門(6.25 %～8.94 %)、球囊菌門(2.14 %～4.12 %)、芽枝菌門(1.19 %～3.19 %)。非根際土壤真菌群落中，優勢類群主要是子囊菌門(48.26 %～50.16 %)和擔子菌門(29.87 %～32.16 %)，其中根際土壤細菌酸桿菌門相對豐度高于非根際，變形菌門相對豐度低于非根際。

由圖5可知，主坐標分析(PCoA)分析表明：不同季節玉米土壤根際和非根際細菌群落具有很好的相似性，并且根際和非根際細菌群落產生明顯的分離效應；玉米土壤根際和非根際真菌群落具有很好的相似性，并且根際和非根際真菌群落產生明顯的分離效應。

圖4 不同季節玉米根際與非根際土壤真菌群落組成Fig.4 Composition of rhizosphere and non-rhizosphere soil fungus community in different seasons

2.5 土壤養分與細菌群落結構的相關性

相關性分析(表3)表明：玉米土壤細菌和真菌Coverage、ACE與土壤養分均沒有顯著的相關性(P>0.05)；土壤pH與土壤細菌和真菌多樣性呈負相關，土壤電導率和全磷與土壤細菌和真菌多樣性均沒有顯著的相關性(P>0.05)。土壤有機碳與細菌Richness、Shannon呈極顯著的正相關(P<0.01)，與細菌Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)；土壤有機碳與真菌Shannon呈極顯著的正相關(P<0.01)，與真菌Richness、Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)。土壤全氮與細菌Richness、Shannon呈極顯著的正相關(P<0.01)，與細菌Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)；土壤全氮與真菌Shannon呈極顯著的正相關(P<0.01)，與真菌Richness、Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)。土壤速效氮與Richness、Shannon、Evenness、Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)，與真菌Shannon、Evenness、Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)。土壤速效磷與細菌Shannon、Chao 1和Simpson呈極顯著的正相關(P<0.01)，與Evenness呈顯著的正相關(P<0.05)；土壤速效磷與真菌Shannon、Evenness、Chao 1和Simpson呈顯著的正相關(P<0.05)。

3 討 論

通過研究分析得知，對于玉米種植區而言，無論是根際土壤，還是非根際土壤，雖然季節不同，但是其變化趨勢基本一致，對于其pH值而言，其先降后升的態勢較為明顯，尤其是春季表現更為突出，其次是冬季、秋季，而夏季變化最小，其值最低。而電導率則與之呈現截然不同的變化，且在夏秋季節，根際與非根際之間是存在較大差異的，其差異達到了顯著水平，也就是我們常說的根際富集現象比較明顯。對于玉米種植區土壤養分而言，隨著季節的變化，其先升后降的變化態勢較為明顯，尤其是有機碳等養分，且最高值出現在夏季，無論是根際土壤還是非根際均是如此。隨著季節的轉換，堿性鹽離子被植被吸收，這使得土壤的酸性更為明顯，在其根際的不斷發展之下，可溶性離子顯著增加，有機酸分泌增多，加之微生物活動的影響，降低了土壤pH值。從中也可以看出，為了促進土壤養分，可以采取降低其pH值的方法進行，這將明顯利于有效養分的利用效率，在可溶離子不斷增多的情況下，電導率也隨之上升[16-17]。

圖5 基于Weighted unifrac 距離的土壤微生物群落的主坐標分析(PCoA)Fig.5 Principal coordinate analysis of soil microbial community based on Weighted unifrac distance (PCoA)

不少學者通過實驗對比分析得知，對于根際及非根際土壤而言，其雖然都是與根系關系密切的土壤分布，但是其養分含量并不相同，且存在的差異較為明顯[18-19]。通過本實驗分析得知，在季節變化的情況下，二者的養分含量水平相差明顯，且二者隨著季節變化而呈現出較為明顯的規律，其先升后降的態勢較為明顯，尤其是夏季表現更為突出，呈現出峰值，其次是秋季、春季，而冬季變化最小，其值最低。對于玉米根際土壤而言，夏秋季節養分含量明顯較高，且與春冬季節的差異呈現顯著水平[20]。在季節變化影響之下，玉米土壤的菌群分布特點呈現較大差異，尤其是細菌及真菌分布，其蓋度、豐度及均勻度都呈現出明顯的季節特點，其先升后降的變化態勢明顯，且根際土壤分布明顯較高，二者呈現較大差異；對于ACE、Chao 1指數亦是如此[22-23]。主要原因在于夏秋季節屬于玉米生長旺盛期，根系生長旺盛的同時分泌較多根系分泌物，對于促進生物量增長作用明顯，加之養分富集效應，形成了更高水平的根系養分含量[22]。此外，對于玉米根系而言，其在降塵物質的作用下及腐殖質影響下，根際沉積更為明顯，這對于微生物活動也起著積極作用[21-22]，能夠促進微生物生長發育，進而加快有機質分解和降解，對于養分的轉化起著積極作用，因此形成更高的養分含量[23-25]。

表3 土壤養分與土壤細菌和真菌多樣性相關性

注：*，**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。

Note: * and ** indicate significant differences at the level of 0.05 and 0.01, respectively.

通過此次玉米種植試驗，無論是根際土壤還是非根際土壤，其pH值與養分之間的相關程度較高，養分與微生物之間的相關程度也較高，對于玉米根系而言，其能夠分泌一定的有機酸，該物質對于養分的活化起著積極作用。在pH值不斷降低的情況下，養分的轉化得以提升，其活化效果更為顯著，在根系呼吸作用下，大量的二氧化碳被釋放，有機酸水平提升，形成了更低的pH值[18-19]。過高或過低的酸性水平均不利于植被生長，也對微生物活動起著不利影響，在其值不斷下降的情況下，根區更容易酸化[20-21,24]。對于玉米而言，春季屬于萌芽期，其長勢并不快，光合作用相對較弱，也并無大量的根際微生物活動；但是到了夏秋季節，長勢逐漸旺盛，生長加速，新陳代謝加快，各項生理特點達到高峰，對于養分及微生物來說均呈現了較為明晰的根際效應，這有利于植被對于養分的吸收利用效率提升，同時對于微生物活動也起著積極作用[25]。進入秋冬季節，玉米生長狀況下降，養分含量呈現大幅下降，微生物活動明顯降低，影響了根際土壤各項指標。

4 結 論

(1)不同季節玉米根際與非根際土壤養分含量(有機碳、全氮和全鉀)隨季節變化趨勢相一致，由春季到冬季，玉米根際、非根際養分含量均呈先增加后降低趨勢，以夏季玉米根際、非根際土壤養分含量最高，冬季玉米根際、非根際土壤養分含量最低，并有所波動。

(2)不同季節玉米根際與非根際土壤細菌和真菌覆蓋度、豐富度指數、Shannon-Wiener 指數、均勻度Evenness、ACE、Chao 1指數、Simpson指數隨季節變化趨勢相一致，由春季到冬季，根際、非根際土壤細菌和真菌多樣性指數均呈先增加后降低趨勢，并且不同季節根際土壤細菌和真菌多樣性指數均顯著高于非根際。

(3)玉米土壤細菌和真菌Coverage、ACE與土壤養分均沒有顯著的相關性(P>0.05)；土壤pH與土壤細菌和真菌多樣性呈負相關，土壤電導率和全磷與土壤細菌和真菌多樣性均沒有顯著的相關性(P>0.05)。玉米土壤根際和非根際細菌和真菌群落具有很好的相似性，并且根際和非根際細菌群落產生明顯的分離效應。