食管鱗癌中TROP2與EMT的表達(dá)及相關(guān)性研究

雷海鳴 李 劍 周鑒基

1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鹽城 224005；2.江蘇省鹽城市第二人民醫(yī)院外科，江蘇鹽城 224003

食管癌是全球一種常見的惡性消化道腫瘤，我國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，在國(guó)內(nèi)惡性腫瘤中其發(fā)病率排第四位，全球約60% 的食管癌發(fā)生在我國(guó)[1]。鱗狀細(xì)胞癌和腺癌是食管癌的主要組織學(xué)類型，大約90%為鱗狀細(xì)胞癌[2]。其早期臨床癥狀不典型，診斷比較困難，雖然外科手術(shù)和放化療等治療方法在不斷發(fā)展，但預(yù)后仍然較差，5 年生存率仍然相對(duì)較低，其主要原因與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等因素有關(guān)。

人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（trophoblastic cell surface antigen 2，TROP2）是一種單跨膜表面糖蛋白，也稱為膜組分表面標(biāo)志物-1 和腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物-2，是TACSTD2 基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)[3]。TROP2 首次被發(fā)現(xiàn)于人類滋養(yǎng)層細(xì)胞中，是侵襲人類滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞周期蛋白D1 和蛋白激酶C（PKC）水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，后者激活有絲分裂原激活的蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ ERK）途徑可以增加細(xì)胞周期蛋白D1 和細(xì)胞周期蛋白E 的表達(dá)[4]。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和自我更新，Trop2 在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中具有多方面的作用[5]。TROP2 是一種致癌基因，與多種類型的惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-10]。 此外，在某些消化道癌癥中，升高的TROP2 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化和其他臨床病理特征顯著相關(guān)[11-12]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在生理或病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，研究發(fā)現(xiàn)，EMT 不僅在人類胚胎的發(fā)育過程中起作用, 也是導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制[13-14]。

本研究通過檢測(cè)TROP2 和EMT 標(biāo)記物在食管鱗癌組織中的表達(dá)，以及癌旁正常組織TROP2的表達(dá)，分析并探討TROP2 與食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月～2019 年10 月江蘇省鹽城市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療的50 例食管癌患者的癌組織、癌旁正常組織（距離癌灶邊緣＞5cm，病理證實(shí)未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞）。所有患者在術(shù)前未發(fā)現(xiàn)明顯手術(shù)禁忌證，均未進(jìn)行放射、化學(xué)和靶向等治療，術(shù)后病理檢查均為鱗狀細(xì)胞癌。男39 例，女11 例，年齡42 ～75 歲，平均61.1 歲。根據(jù)第8 版AJCC食管癌TNM 分期：Ⅱ期32 例，Ⅲ～Ⅳ期18 例。浸潤(rùn)深度：T1 ～T2 40 例，T3 ～T4 10 例。組織分化程度：高分化3 例，中分化35 例，低分化11 例，未分化1 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13 例，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37 例。見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）所有患者術(shù)前和術(shù)后病理組織檢查均已確診；（2）無(wú)嚴(yán)重心臟及肝臟疾病、凝血功能障礙；（3）術(shù)前均未進(jìn)行放射、化學(xué)和靶向等治療。

1.3 方法與主要試劑

用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TROP2 及EMT 相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)，兔多克隆抗TROP2 抗體、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 抗體購(gòu)自（美國(guó)Santa Cruz公司），山羊抗兔二抗（凱基生物科技有限公司）。采用SP 法，10%甲醛固定標(biāo)本后石蠟包埋，行連續(xù)切片，每張組織切片4μm，烤片2h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，0.01mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復(fù)，3%H2O2孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗（稀釋比例TROP2 為1 ∶100，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 為1 ∶200），4℃孵育過夜，PBS 清洗3次，每次5min，二抗在37℃下孵育30min，PBS 清洗3 次，每次5min，DAB 室溫顯色，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀測(cè)并拍照。

1.4 結(jié)果判斷

鏡下觀察，每張切片選取5 個(gè)高倍視野（×400），按細(xì)胞是否著色分為陽(yáng)性和陰性，TROP2、E-cadherin 和N-cadherin 的陽(yáng)性著色均位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Vimentin 陽(yáng)性著色位于細(xì)胞質(zhì)（圖1），均呈棕黃色顆粒，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例進(jìn)行評(píng)分，＜20%為陰性，≥20%為陽(yáng)性。

圖1 食管鱗癌組織中TROP2、N-cadherin，vimentin 和E-cadherin 的表達(dá)（×400）A.TROP2；B.N-cadherin；C.Vimentin；D.E-cadherin

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TROP2在食管鱗癌與癌旁正常組織中的表達(dá)

50 例食管鱗癌組織中TROP2 的陽(yáng)性表達(dá)率為62.0%（31/50），癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率為19.0%（8/42），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.236，P ＜0.001）。

2.2 TROP2的表達(dá)與臨床病理資料間的關(guān)系

TROP2 在不同性別、年齡、浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期中的表達(dá)情況見表1。TROP2 的表達(dá)與患者的性別（χ2=0.160，P=0.899）、年 齡（χ2=0.536，P=0.464）無(wú) 關(guān)，與 組 織 學(xué) 分級(jí)（χ2=5.898，P=0.015）、浸 潤(rùn) 深 度（χ2=4.160，P=0.041）、臨床分期（χ2=8.631，P=0.003）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.273，P=0.007）有關(guān)。

表1 TROP2的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 食管鱗癌中TROP2的表達(dá)與EMT相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性

TROP2、N-cadherin、Vimentin 和 E-cadherin在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.0%、54.0%、56.0%、40.0%。分析顯示，食管鱗癌組織中TROP2 的表達(dá)與N-cadherin 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.352，P=0.012)，與Vimentin 表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.468，P=0.001)，而與E-cadherin 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.454，P=0.001)。見表2。

3 討論

食管鱗癌是食管癌的最主要類型，其特點(diǎn)是侵襲性高、預(yù)后較差，發(fā)生發(fā)展與多種因素密切相關(guān)，侵襲和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。尋找可靠的預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)志物，對(duì)于食管鱗癌的預(yù)后判斷、提高療效具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（TROP2）由323 個(gè)氨基酸組成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中被糖基化，是一種鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，作為腫瘤驅(qū)動(dòng)因子可驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤生長(zhǎng)[15]，在惡性腫瘤進(jìn)展中起重要作用[16]。TROP2 的表達(dá)和（或）活性改變與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲和存活有關(guān)，是惡性腫瘤患者預(yù)后的潛在標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果顯示，TROP2 在食管鱗癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織（P ＜0.05），提示TROP2 可作為食管鱗癌診斷的分子標(biāo)志物。其表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)明顯相關(guān)（P ＞0.05），與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及TNM 臨床分期有相關(guān)性（P ＜0.05），提示TROP2 對(duì)食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有促進(jìn)作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）被認(rèn)為在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[18]，在此過程中，上皮細(xì)胞失去其特性，并獲得間質(zhì)表型，EMT 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，導(dǎo)致免疫抑制，并阻止細(xì)胞凋亡和衰老[19]。N-cadherin 的表達(dá)上調(diào)及E-cadherin的表達(dá)下調(diào)是EMT 的主要表現(xiàn)[20]。Trop2 通過誘導(dǎo)乳腺癌中EMT 過程促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，導(dǎo)致淋巴結(jié)受累和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[21]。膽囊癌中，TROP2 可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 途徑誘導(dǎo)EMT 來(lái)促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[22]。通過對(duì)食管鱗癌組織中TROP2 與EMT 相關(guān)標(biāo)記物的相關(guān)性分析，提示TROP2 可能通過調(diào)控EMT 標(biāo)記物的表達(dá)而促進(jìn)EMT 的發(fā)生，在食管鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

總之，在食管鱗癌組織中TROP2 高表達(dá)，可能與食管鱗癌的進(jìn)展密切相關(guān)，TROP2 可以作為食管鱗癌的潛在治療靶標(biāo)。多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路等因素可調(diào)控EMT 的發(fā)生，TROP2 可能具有誘導(dǎo)食管鱗癌中EMT 過程的作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，有待后期進(jìn)一步的研究。