實驗室檢測蘋果汁中甜蜜素的能力分析

景贊，劉超，劉曉碧

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000）

甜蜜素是一種人工合成的甜味劑，在食品工業生產中具有甜度高、用量少、價格低等優點，因而應用廣泛。GB 2760 食品添加劑使用標準中，對甜蜜素的使用范圍和限量都有明確規定，但分析近幾年國家公布的抽檢數據發現，甜蜜素濫用問題比較突出，白酒、饅頭中檢出較多，食品安全形勢依然嚴峻，對檢驗檢測機構的能力要求也越來越高[1-3]。

能力比對作為一種提升檢測水平的手段在質量控制中較為常見，通過比對考核能夠發現和檢驗各環節中的干擾因素，評估其對測定結果的影響大小，識別實驗室中的問題并制定相應的措施，從而提升檢測機構的能力水平[4-7]。本文著眼于蘋果汁中的甜蜜素含量測定，分別采用氣相色譜法和液質聯用法對樣品進行檢測，通過此次考核加強食品安全檢測的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素標準品，純度99.7%，購于壇墨質檢科技股份有限公司；正庚烷，色譜純；賽默飛世爾科技（中國）有限公司；亞硝酸鈉、硫酸、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

氣相色譜儀，7890A，安捷倫科技中國有限公司；液質聯用儀，API3200，AB SCIEX 公司。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 氣相法

稱取甜蜜素標準品適量，用超純水稀釋至1 000 μg/mL，準確移取0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、4.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得到濃度為10、20、40、80、100、160 μg/mL 的標準系列工作溶液。

1.3.2 液質法

準確移取上述標準品（1 000 μg/mL）1.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得到濃度為10 μg/mL 的標準中間溶液，分別移取0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用超純水定容，得到濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL 的標準系列工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 氣相法

蘋果汁試樣搖勻后稱取10.000 0 g，用水定容至25 mL，準確移取10.0 mL 試樣于50 mL 帶蓋離心管中。置于冰浴10 min 后，加入5.0 mL 正庚烷，分別加入2.5 mL亞硝酸鈉和硫酸溶液，蓋緊蓋子，搖勻，在冰浴中放置30 min，其間振搖5 次。加入2.5 g 氯化鈉，蓋上蓋子后振搖80 次，低溫離心（3 000 r/min）10 min 分層，取上清液經0.22 μm 有機濾膜過濾后待測定。

1.4.2 液質法

蘋果汁試樣搖勻后，稱取1.000 0 g，用水定容至100 mL搖勻，取1 mL 定容至5 mL，經0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后待測定。

1.5 儀器條件設置[8]

1.5.1 氣相法

進樣口溫度：220 ℃，分流比：10:1；色譜柱：HP-5 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱溫箱升溫程序：初始溫度60 ℃（保持2 min），以10 ℃/min 升至90 ℃（保持0.5 min），再以20 ℃/min 升至230 ℃，保持3 min；流速：2 mL/min；進樣體積：1 μL；載氣：高純氮氣；FID 檢測器溫度：260 ℃。

1.5.2 液質法

（1）液相條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相:甲醇、10 mmol/L 乙酸銨溶液。

梯度洗脫：0.01 min，5%甲醇；0.01～5.00 min，甲醇5%～15%；5.00～8.00 min，甲醇15%～30.0%；8.00～9.00 min，甲醇30.0%～80.0%；9.00～13.00 min，甲醇80.0%～80.0%、13.00～13.10 min，甲醇80.0%～5.0%；13.10～15.00 min，甲醇5.0%～5.0%。

（2）質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；監測方式：多反應監測MRM；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱器、碰撞氣均為高純氮氣；IS：-4 500 V；GS1：30 Psi；CUR：30 Psi；GS2:30 Psi；溫度：500 ℃；CAD：110 mL/min。具體質譜條件見表1。

表1 甜蜜素質譜參數Table 1 MRM parameters of sodium cyclamate

2 結果與分析

2.1 檢測方法的選擇

目前檢測甜蜜素的方法有氣相色譜法、液相色譜法、液質聯用法，氣相和液相法均需要衍生化，液質法純水稀釋后直接測定，從前處理看液質法有很大優勢。考慮到對比衍生化和未衍生、色譜與質譜，最終選擇氣相色譜和液質聯用法[9-11]。甜蜜素標準色譜圖見圖1、2。

2.2 影響分析結果的因素和關鍵控制點

標準品要穩定、來源可靠，且要求帶有檢驗報告證書，同時按照標明的儲存條件進行存放，使用前溫度應恢復至室溫。能力考核樣接收時是冷藏狀態，實驗室也應存放在冷藏環境中，在使用前恢復至室溫并充分混勻。檢測過程中用到的移液器、容量瓶、移液管等器具應檢定校準，如無法校準檢定應通過自校，保證器具的準確性[12]。氣相法測定中衍生環境的控制尤為重要，移取10 mL樣品至離心管預冷階段應盡可能長，衍生溫度最好控制在10 ℃以下，同時對冰浴水溫的均一性也要注意，可以購買帶循環水功能的冰浴設備，否則應間隔攪動，防止水溫不均造成衍生效果不好。氣相色譜襯管的清潔程度會影響目標物的響應值，檢測時應及時更換，同樣液質離子源也應及時維護清潔。測定標準溶液時，盡量不要使用儀器自動稀釋功能，可能會帶來較大的偏差。樣品基質的影響在檢測中也不能忽略，試驗考察了蘋果汁基質配標與純溶劑配標的差異性，結果顯示兩者峰面積近似，帶來的偏差很小。

2.3 方法的線性關系

以濃度為橫坐標，響應值為縱坐標，繪制標準曲線，在所測定濃度范圍內，線性關系良好，結果見表2。

表2 甜蜜素的線性范圍Table 2 Linear range of sodium cyclamate

2.4 實際樣品測定

將能力考核樣平均分成10 份，按照上述氣相色譜法和液質聯用法前處理方法進行提取測定，結果見表3。

將兩種方法測定的結果進行t檢驗分析，樣本量n＝10，自由度df＝9，雙側檢驗α＝0.05，計算結果P＞0.05。統計上沒有顯著性差異，可以認為氣相色譜法與液質聯用法在測定蘋果汁甜蜜素時結果間無顯著性差異。

2.5 統計結果分析

此次能力考核參加單位共有15 家，統計結果數據采用穩健統計法，包括計算結果數、中位值、標準化四分位距、穩健變異系數、最小值、最大值和極差。再根據中位值和標準化四分位距計算出實驗室間Z比分數（ZB）和實驗室內Z比分數（ZW），依據Z比分數評定實驗室的結果，定義為|Z|≤2 為滿意，2＜|Z|＜3 為可疑，|Z|≥3 為不滿意[9]。蘋果汁中甜密素測定的ZB、ZW柱狀圖見圖3、4。

表3 氣相法和液質法結果比較Table 3 Comparison of testing results by GC and LC-MS/MS

根據統計結果，本實驗室ZB、ZW值均小于2，結果較為滿意，參加能力考核的15 家實驗室中，其中1 家結果可疑，2 家結果為不滿意，實驗室出現可疑或者不滿意結果時，可以從影響結果因素和關鍵控制點分析產生問題的原因，建立相關糾正措施，做好標準物質和試劑的驗收保管，加強人員業務培訓，規范儀器設備維護保養，對新方法、新儀器的使用進行集中培訓學習，同時實驗室的內部質控也很重要，通過購買相應的質控樣進行處理，是保證結果準確穩定的有效手段。

3 討論

本文分別采用氣相色譜法和液質聯用法測定蘋果汁中甜蜜素含量，并對測定結果進行差異顯著性分析，同時從自身實驗室角度，總結了甜蜜素檢測環節中的影響因素和關鍵控制點，對于能力驗證出現可疑或者不滿意結果的其它實驗室可作為參考，建立相關的糾正和預防措施，不斷提升實驗室檢測能力水平。