新生兒糞便中分離的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)RZ18提高腸道黏膜屏障完整性

李艷茹，張騰勛，郭聰聰，張同存，齊 威，王 楠

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization，FAO)和世界衛生組織(World Health Organization，WHO)對益生菌定義為一種活的微生物，在給予足夠劑量時對宿主的健康起有益作用[1].益生菌仍然以乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)為主.乳酸菌是指能發酵糖，主要產生乳酸的一類細菌的總稱．益生菌作為對機體有益的微生物，在預防和治療多種腸道疾病方面廣泛應用[2]，包括腹瀉、腸易激綜合征、新生兒壞死性小腸結腸炎、麩質不耐癥、胃腸炎和復發的慢性腸炎等[3-5]．隨著越來越多的證據表明益生菌對機體具有有益作用，益生菌菌株已經廣泛應用于各種食品中，如酸奶、泡菜、米酒及嬰幼兒益生菌產品．

嬰幼兒時期是機體各項功能形成和完善的時期，也是腸道微生態形成的重要階段．來自無菌動物的研究表明，體內定植的微生物對動物早期腸道形態發育、腸上皮細胞增殖、免疫系統分化等腸道發育過程有重要影響[6-7]．通過微生物干預，尤其是益生菌干預，有效地增強腸道的消化吸收能力，促進黏膜屏障、免疫快速成熟，進而提高機體防疫能力，對于嬰幼兒的健康發育具有重要意義．因此，本研究旨在從新生兒糞便中分離篩選安全、有效的益生菌，為開發對腸道炎癥疾病具有預防和治療作用的新菌株提供實驗依據．

腸黏液層是抵御腸內致病菌及有害物質入侵的第一道屏障，黏蛋白 2(mucin2，MUC2)是構成腸黏液層的最重要蛋白質，其數量及結構的改變與腸黏膜屏障損傷發生發展密切相關．腸上皮細胞緊密連接(tight junction，TJ)是腸黏膜屏障的重要組成部分，一旦 TJ受損，腸上皮細胞間的通透性增加，細菌內毒素和大分子物質就可通過緊密連接進入體循環，與多種疾病的發生發展有關．閉鎖蛋白(occludin，OCLN)、封閉蛋白 1(claudin1，CLDN1)、閉鎖小帶蛋白 1(zonula occluden-1，ZO-1)是緊密連接中重要的3個蛋白[8]．因此研究從健康嬰兒糞便中分離的LAB對此4種蛋白表達的影響，可反映該菌對促進腸道黏膜屏障完整性的作用及作用機制．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品、細胞和菌株

出生一個月內嬰兒的糞便樣品由自天津藍海蘭母嬰家政服務有限公司開發區分公司提供．SW620細胞，徐州醫科大學惠贈．HT-29細胞，天津科技大學滕玉鷗老師惠贈．COS-7細胞，購自美國菌種保藏中心(ATCC)．藤黃微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49732、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CMCC54002、大腸桿菌(Escherichia coli)CMCC44102為本實驗室保藏菌種．pMUC2-lucpGL3質粒本實驗室構建．

1.1.2 試劑與儀器

MRS肉湯，北京奧博星生物技術有限責任公司；鹽酸，天津市江天化工技術有限公司；牛膽鹽，廣東環凱微生物科技有限公司．DMEM/F12培養基、RPMI 1640培養基，Gibco公司；胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物工程公司；M-MLV 逆轉錄酶、Trizol試劑，北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green qPCR Mastermix，DBI Bioscience公司；dNTPs，北京康為世紀生物科技有限公司；Luciferase Assay System(E1501)，Promega 公司；claudin1(YT0942)一抗、ocludin(YN2865)一抗、zo-1(YN1410)一抗、MUC2 ELISA 檢測試劑盒，ImmunoWay公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，Santa Cruz公司；IRDye-800標記山羊抗小鼠二抗、IRDye-800標記山羊抗兔二抗，美國 Li-COR公司；TurboFect轉染試劑，Thermo公司．

多功能酶標儀，美國Thermo有限公司；轉膜儀，Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統，美國LI-COR公司；stepone plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司．DG 250厭氧培養箱，英國Don Whitley Scientifi(DWS)公司；pH 計，梅特勒-托利多儀器上海公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠．

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、篩選

使用平板劃線法對菌落進行純化．將糞便樣品梯度稀釋到10-6涂布到添加碳酸鈣的固體MRS培養基表面，37 ℃培養48h，挑選產生溶鈣圈的菌落反復在 MRS培養基上劃線，仔細鑒別不同菌落的形態特點并進行革蘭氏染色．同時，將菌株用甘油管于－80℃凍存．提取基因組，對其進行 PCR擴增，將擴增產物送往金唯智生物科技有限公司測序，然后采用BLAST對結果進行16S rDNA比對．

耐酸能力測定：菌株于 MRS液體培養基中37℃厭氧培養箱培養，經過 3次活化，每次培養12h，對活化后得到的菌液離心收集菌體分別重懸于pH 為 2.0、3.0、4.0的液體 MRS培養基中[9]，調整菌體密度為5×108mL-1．取100μL菌液于96孔板中，每個樣液做 3個復孔，同時以常規 pH MRS培養基組作為陰性對照．置于 37 ℃厭氧培養箱中培養4h．利用 MTT法，在 490nm 處測定吸光度(A)，按照式(1)計算存活率[10-11]．

耐膽鹽能力測定：菌株于 MRS液體培養基中37℃厭氧培養箱培養，經過 3次活化，每次培養12h，對活化后得到的菌液離心收集菌體重懸于含0.1%～0.3%膽鹽的液體MRS培養基中[12]，調整菌體密度為5×108mL-1．置于37 ℃培養箱中培養4h．按照1.2.2節的方法測定存活率[13]．

1.2.2 菌株活化、樣品制備及細胞培養

將保存在－80℃菌種常溫下解凍，于 2%接種于MRS液體培養基中，經過2次活化，每次培養12h，最終接菌于 100mL培養基中，同時以 100mL空白培養基為對照組，12h后離心，取上清液，50℃旋蒸1.5h左右，倒入玻璃培養皿中，放入-80℃冰箱24h，于凍干機中凍干處理．凍干樣品重懸于細胞培養基中．

HT-29、COS-7細胞用含 10% FCS 的 F12培養基(含 1×105U/L青霉素和 100mg/L鏈霉素)，SW620用含10% FCS 的RPMI 1640培養基(含1×105U/L青霉素和 100mg/L鏈霉素)，在 37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，24h后換液，以后每 2、3d更換1次培養液．細胞長滿后，用2.5g/L胰酶消化后傳代．

1.2.3 結腸細胞黏附能力測定

SW620細胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 96孔板中培養 2d，將已長至單層的人結腸癌細胞SW620用滅菌的 PBS(pH 7.4)漂洗 2次，將 100μL乳酸菌(5×108mL-1)加入96孔細胞板中，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育1h后，用滅菌的PBS漂洗3次，以洗去未黏附的菌．應用MTT法分別測定PBS漂洗后的益生菌(A黏附菌)、未漂洗的益生菌(A總菌)及未加菌空白對照(A對照)孔的吸光度，按照式(2)計算黏附率．

1.2.4 酶聯免疫吸附(ELISA)實驗

HT-29細胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養 2d，經加入 5mg/mL 凍干的發酵液的上清液處理24h后，收集細胞培養基上清液，采用酶聯免疫吸附法檢測細胞培養基上清液中 MUC2水平，試劑盒采用人 MUC2ELISA檢測試劑盒．檢測方法按說明書進行．

1.2.5 熒光素酶活性檢測

以 104mL-1密度均勻鋪種 COS-7 細胞于 24孔板中，鋪種24h后用TurboFect轉染試劑對pMUC2-luc質粒進行轉染，轉染6h后換液，并將已處理的樣品以5mg/mL的濃度加入已轉染質粒的24孔板培養基中．繼續培養24h后，棄去上清液，在24孔板每孔加入100μL的裂解液，裂解30min，再用細胞刮刀刮下細胞，將裂解的蛋白50μL加入白色96孔板中，同時加入熒光素酶化學發光底物 100μL，迅速放入酶標儀中進行檢測其熒光值．

1.2.6 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

HT-29細胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養 2d，經加入 5mg/mL 樣品處理 24h后，Trizol法提取HT-29細胞中RNA，用M-MLV逆轉錄酶逆轉錄 2μg樣品．Real-time PCR法檢測 MUC2、OCLN、CLDN1、ZO-1基因的表達．PCR 體系：10μL DDW，7.6μL Mix，0.4μL Rox，0.5μL 上游引物，0.5μL下游引物，1μL cDNA模板．PCR反應條件：95℃預變性 2min，95℃變性 10s，60℃退火和延伸30s，共 40個循環，95℃終止反應 15s．所用引物見表 1．

表1 引物Tab. 1 Primers

1.2.7 免疫印跡(Western blot)

HT-29細胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養 2d，經加入 5mg/mL樣品處理 24h后，收集總蛋白．蛋白進行電泳、轉膜，浸入封閉液中封閉1h．分別加稀釋后的 ZO-1一抗(1﹕1000)、CLDN1一抗(1﹕1000)、OCLN 一抗(1﹕1000)和 GAPDH一抗(1﹕3000)，4 ℃孵育過夜，山羊抗兔(1﹕10000)或山羊抗鼠(1﹕10000)二抗室溫下避光孵育1.5h，將 NC膜平鋪于遠紅外成像儀中，設置程序掃膜，保存數據．

1.2.8 抑菌能力檢測

取 106mL-1的 M.luteus、L.monocytogenes、S.aureus、E.coli菌懸液 50μL作為指示菌(菌體濃度為 108mL-1)，涂布于已凝固的瓊脂平板上，平衡30min．無菌操作：將 3只無菌牛津杯(直徑 8cm)輕輕放在平板上，杯內分別加入106mL-1的RZ18菌懸液、MRS培養基 30μL．平放 37℃孵箱培養 16～18h，觀察抑菌圈的大小，抑菌圈直徑＞8mm，則判斷為敏感菌株，表明有抑菌效果[14]．

1.3 統計學分析

實驗數據結果以“平均值±標準差”表示，數據由 Graphpad Prism 5.0進行統計分析，*、**分別表示有統計學差異P＜0.05、P＜0.01．

2 結果與分析

2.1 LAB耐酸能力

對從新生兒糞便中分出的15株LAB的耐酸、耐膽鹽及細胞黏附進行初步檢測，篩選出5株相對抗逆性較好的 LAB，分別是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)RZ18和 RZ002、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)RZ003和RZ004、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)RZ005．人體胃液pH通常為2.0左右，隨進食時間延長，逐漸上升至pH 5.0左右，胃排空時間一般為 3～4h．要成為食源性的益生菌，應該具有一定的耐酸性．對 5株菌的耐酸能力進行檢測，結果如圖 1所示．

圖1 5株乳酸菌耐酸能力分析Fig. 1 Acid resistance analysis of the five LAB strains

在pH 2時，L.casei RZ003和RZ004存活率均較低，分別為(12.41±0.13)%和(11.27±0.12)%，其他3種菌 E.faecalis RZ18、RZ002以及 P.acidilactici RZ005存活率在 20%左右．在 pH 3時，L.casei RZ003存活率最低，僅為(13.69±0.24)%，其他 4種菌 E.faecalis RZ18、RZ002 和 L.casei RZ004、P.acidilactici RZ005存活率在20%左右．在pH 4時，L.casei RZ004存活率最高，可達(72.64±0.11)%，其他4種菌E.faecalis RZ18、RZ002和L.casei RZ003、P.acidilactici RZ005存活率均在40%～50%．

2.2 LAB耐膽鹽能力

人體腸道內膽汁濃度是變化的，膽鹽含量總體在0.03%～0.3%的范圍內波動．本研究中研究了 5株LAB對 0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的耐受能力進行分析．結果如圖 2所示，在含有 0.1% 膽鹽培養基中培養 4h后，E.faecalis RZ18和 RZ002、P.acidilactici RZ005存活率在 100%以上，說明在 0.1%的膽鹽環境中并不會影響這 3株菌的生長．在含有 0.2%膽鹽培養基中培養4h后，P.acidilactici RZ005存活率最高，可達(57.2±1.57)%，其他 4株菌均在 25%～35%. 在含有0.3%膽鹽培養基中培養4h后，各菌存活率相差不大，均在20%～35%．

圖2 5株乳酸菌耐膽鹽能力分析Fig. 2 Analysis of bile salt tolerance of the 5 LAB strains

2.3 LAB黏附能力

LAB在腸道的黏附定植部位主要發生在結腸，因此本研究采用人結腸癌細胞 SW620模擬腸道環境，通過 MTT法測定不同 LAB對結腸細胞黏附能力的差異．結果如圖3所示，E.faecalis RZ18、RZ002和 P.acidilactici RZ005的黏附能力較強，其中P.acidilactici RZ005最強為(51.96±9.06)%．

圖3 5株乳酸菌對人結腸癌細胞的黏附能力分析Fig. 3 Adhesion analysis of the five LAB strains to human colon cancer cells

2.4 LAB發酵上清液對 HT-29細胞中 MUC2蛋白表達的上調作用

黏蛋白(MUC)是由體內多種上皮細胞分泌的大分子糖蛋白，包括 MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6-7、MUC1、MUC3-4、MUC13 和 MUC17 等多個亞型．MUC2屬于分泌型黏蛋白，在腸道的表面形成黏液層發揮潤滑和拮抗致病菌的腸道黏附和侵襲的作用，是黏液屏障中重要蛋白之一．MUC2表達量的上調表明其黏液屏障更加完善．5mg/mL發酵上清液處理HT-29細胞24h后，利用ELISA方法檢測細胞培養基中 MUC2的含量，結果如圖 4所示，E.faecalis RZ18發酵上清液可使MUC2蛋白的表達量上調，與對照組相比，具有統計學意義(*P＜0.05)．

圖4 5株乳酸菌發酵上清液對MUC2蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of fermentation supernatant from the five LAB strains on MUC2 protein expression

2.5 E. faecalis RZ18發酵上清液增強 MUC2啟動子活性及轉錄水平

利用 E.faecalis RZ18菌株發酵上清液處理COS-7細胞同時轉染 pMUC2-luc質粒，采用熒光素酶報告基因檢測方法檢測 MUC2啟動子活性，結果如圖5所示，E.faecalis RZ18發酵上清液可顯著上調MUC2的啟動子活性(*P＜0.05)．

圖5 E.faecalis RZ18發酵上清液對 MUC2啟動子活性的影響Fig. 5 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the promoter activity of MUC2

用E.faecalis RZ18菌株發酵上清液處理HT-29細胞 24h后，Real-time PCR方法檢測 MUC2的mRNA水平，結果(圖6)發現 E.faecalis RZ18發酵上清液能顯著上調MUC2mRNA的水平(*P＜0.05).這些結果進一步證實E.faecalis RZ18的發酵上清液可以促進MUC2的轉錄水平升高．

圖6 E.faecalis RZ18發酵上清液對 MUC2 mRNA水平的影響Fig. 6 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of MUC2

2.6 E.faecalis RZ18發酵上清液上調 OCLN、CLDN1、ZO-1蛋白的表達水平

腸黏膜通透性的變化與腸黏膜緊密連接蛋白的一系列改變有關，提高腸道ZO-1和OCLN mRNA及其蛋白水平的表達，可增強其腸道屏障功能[15]，CLDN1表達水平下調可以作為評價腸道黏膜屏障功能是否發生障礙的重要指標[16]．利用RZ18菌株發酵上清液處理HT-29細胞24h后，利用Real-time PCR和WB方法檢測OCLN、CLDN1、ZO-1的mRNA和蛋白水平，結果如圖7和圖8所示．

圖7 E.faecalis RZ18發酵上清液對 CLDN1、OCLN、ZO-1 mRNA水平的影響Fig. 7 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of CLDN1，OCLN and ZO-1

圖8 E.faecalis RZ18發酵上清液對 CLDN1、OCLN、ZO-1蛋白水平的影響Fig. 8 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the protein level of CLDN1，OCLN and ZO-1

結果表明，E.faecalis RZ18發酵上清液可顯著上調緊密連接蛋白CLDN1、OCLN、ZO-1的mRNA水平，與對照組相比，具有統計學意義(*P＜0.05，**P＜0.01)．同時，E.faecalis RZ18發酵上清液可顯著上調緊密連接蛋白 CLDN1和 OCLN的蛋白水平(*P＜0.05)，也可增加 ZO-1的蛋白水平，但與對照組相比差異不顯著．

2.7 E.faecalis RZ18對M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli的抑制作用

利用牛津杯法檢測RZ18對M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli等 4種致病菌的抑制作用，結果表明：RZ18對 S.aureus、M.luteus、L.monocytogenes、E.coli有不同程度的抑制作用，其中對M.luteus、E.coli抑制效果較差，抑菌圈直徑僅為(17±0.30)mm、(17±0.25)mm；對 L.monocytogenes抑菌圈直徑為(18±0.23)mm；對 S.aureus抑制效果最明顯，抑菌圈直徑達(21±0.16)mm．M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes是革蘭氏陽性菌，E.coli為革蘭氏陰性菌，因此，E.faecalis RZ18對革蘭氏陽性和陰性菌均有一定抑制作用．

3 討 論

益生菌可通過調節腸道菌群、增強機械屏障、調節腸黏膜免疫功能，從而在生物屏障、機械屏障、免疫屏障 3個層次增強腸黏膜屏障．嬰兒時期是腸道菌群建立的關鍵時期，若此時腸道菌群構造合理、代謝平衡，那么今后機體腸道屏障發育將更加完善，進而為機體減少各種代謝類疾病風險[17-19]．動物研究表明，鼠李糖乳桿菌GG能夠增強新生小鼠腸上皮細胞的增殖、遷移、分化、屏障功能的形成[20]．李碧瑩[21]發現通過對嬰幼兒口服益生菌，能有效調節胃腸道細菌的生長及繁殖，改善胃腸菌群失衡狀況，同時能夠維持腸細胞的完整性，修復因感染輪狀病毒所致腸黏膜損傷，加速恢復胃腸黏膜屏障正常功能，從而提高對嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉的臨床療效．由于嬰幼兒腸道屏障發育與體內定植益生菌關系密切，因此本研究選用新生兒糞便作為菌種來源，希望可以獲得更安全、能在機體定植、具有促進腸道屏障發育和完整性的新型益生菌．本研究從新生兒糞便中分離出一株具有促進腸道黏液 MUC2表達的菌株E.faecalis RZ18．

Claudin1是緊密連接跨膜蛋白，對維持腸上皮細胞屏障功能和緊密連接的完整性具有重要作用，細胞旁 Claudin蛋白作為細胞間緊密聯接通道，具有電通道的作用．跨膜蛋白 Occludin可增強成纖維細胞間的黏附性，增加跨膜電阻[22]，調節細胞間的通透性[23].研究[24]表明，腸致病菌及其毒素通過下調 Occludin蛋白表達的途徑破壞TJ結構．ZO-1是構成緊密連接的重要成分之一，能與其同源體 ZO-2、ZO-3一起為緊密連接的許多跨膜蛋白和細胞質緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺．多數情況下只要ZO-1受到破壞，緊密連接的功能大多會隨之發生變化，而 ZO-1蛋白增加，提示其能增強上皮組織的緊密連接以及結構的完整性，使腸道上皮細胞組織的選擇性通透性增強，因此 ZO-1常被用來作為觀察機體內各種組織的緊密連接屏障功能和通透性功能的指標．本研究發現糞腸球菌 RZ18能上調 Claudin1、Occludin、ZO-1的水平，說明嬰幼兒體內早期定植的糞腸球菌可能對于腸道屏障的完整性具有一定的促進作用．

長期的科學研究表明，人類腸道中廣泛存在的乳酸菌在膳食應用上具備良好的安全性[25]．臨床研究最多的乳酸菌是雙歧桿菌和乳酸桿菌，糞腸球菌和某些非致病性芽胞桿菌及兼性厭氧地衣芽胞桿菌也有所涉及．糞腸球菌被認為是一種條件致病菌，在人的免疫力低下或大量使用抗生素時可導致尿路感染、心內膜炎、腹膜炎、傷口感染等疾病[26]，但在一般情況下對人體和動物是沒有危害的，屬于人和動物體內的常在菌，并能有效抑制有害菌，增殖有益菌，可作為益生菌制劑組方發揮藥理作用．目前對于糞腸球菌作為益生菌在人和動物體內的作用和應用已有一些相關報道．Tinrat等[27]分離出一株具有較好的抑菌效果的糞腸球菌 MTC1032，該菌株通過產酸和細菌素有效抑制了多種病原菌，具有抑菌性，并能夠在酸性條件下生存．在安全性評價中，MTC1032能夠黏附于宿主上皮細胞，并能明顯抑制病原細菌黏附.Zheng等[28]研究采用含嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和蠟樣芽胞桿菌的益生菌組合，通過高通量測序監測血液指標和微生物多樣性，減少胃切除術引起的生理障礙．他們認為益生菌聯合用藥通過改變腸道菌群，顯著增強患者的免疫應答，減輕炎癥的嚴重程度．薛勝平等[29]用酪酸菌、腸膜芽胞桿菌和糞腸球菌組方制備益生菌制劑，藥理作用是調節腸道菌群，增殖有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌等，抑制有害菌，從而有整腸作用．甘利平等[30]在雞的飼糧中添加糞腸球菌雖對肉仔雞的生長性能沒有顯著影響，但可改善腸道健康，尤其對早期雞只腸道的健康生長起到促進作用．董正林[31]研究發現日糧中添加微囊化糞腸球顯著提高了一定日齡肉雞平均體質量，并顯著增加肉雞肝臟指數及肉雞血清 IgA、IgM 含量，且顯著增加肉雞盲腸乳酸桿菌數量和降低肉雞盲腸大腸桿菌數量．魏清甜[32]研究發現，添加 200g/t的糞腸球菌能夠顯著改善試驗仔豬保育前期平均日增質量、料重比、腹瀉率和保育后期的平均日采食量，能夠增強體液免疫性能，明顯提高保育仔豬對飼料中粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率，并對仔豬的腸道發育有一定的促進作用，可降低空腸中 E.coli的數量，促進仔豬盲腸微生態的平衡．

本研究從新生兒糞便中分離出一株糞腸球菌E.faecalis RZ18，其對多種致病菌有一定的抑制作用，并且對腸道黏膜屏障中重要的蛋白 MUC2、CLDN1、OCLN、ZO-1表達有上調作用，有望應用于小兒或成人炎癥性腸病的預防與治療．同時，研究證實嬰幼兒體內早期定植的糞腸球菌可能對嬰兒腸道黏膜屏障完整性的發育有促進作用，這為開發相應益生菌制劑及功能食品提供了參考依據．