黃芪丹參配伍提取物在缺血性心肌中抑制心肌重塑的作用

李夢華， 張瓅方

(1.南陽醫學高等專科學校，南陽 473061；2.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，南陽 473004)

由國家心血管中心發布的《中國心血管病報告2018》中明確指出，中國成年人群中75%存有心血管問題，心血管患病人數接近3億人次，占據國內居民因疾病死亡的40%以上，死亡率居首位。中國已經成為全球心臟病死亡人數最多的國家[1-2]。心肌梗死(mycardial infarction,MI)是影響人類健康的重要疾病之一，中國自2002年開始MI死亡率就一直呈現快速上升態勢。雖然較早采取藥物溶栓、行冠狀動脈旁路移植術、經皮冠狀動脈介入治療等措施，MI死亡率有所下降，但部分患者在服藥或術后依然出現心室重塑(ventricular remodeling，VR)和心力衰竭(heart failure，HF)等并發癥[3]。MI早期發生的VR表現為梗死區心肌細胞出現炎癥壞死、結構纖維化，隨著病情發展，波及到非梗死區心肌細胞代償性肥大、細胞凋亡、細胞外基質結構重建，加重心力衰竭甚至心臟破裂[4-5]。研究證實心肌炎癥、纖維化、凋亡及內皮細胞功能障礙是MI后心肌重塑的典型病理特征[6]，如何有效逆轉MI心室重塑，延緩MI導致的慢性心力衰竭，是近年來研究缺血性心臟病的熱點之一。早在東漢時期醫圣張仲景在《傷寒雜病論》中記載“干血不去，灌溉不周”，中醫認為血脈循行依賴于氣的推動，因此有著“氣為血之帥，血為氣之母”的理論闡釋。遍覽歷代中醫在治療血瘀、血虛等疾病時，多將補氣與活血藥物聯合使用。有研究統計，在治療心絞痛、心肌梗死、心律失常等血管病時，黃芪、丹參占據藥物使用頻率前十位，且協同使用時效果優于單味藥物[7-8]。課題組前期通過黃芪丹參配伍提取物對MI模型大鼠進行干預后發現，聯合使用可協同增強大鼠心臟舒縮功能，減少腦鈉尿鈦(brain natriuretic peptide,BNP)分泌，延緩心力衰竭[9]。在此工作基礎上，課題組假設黃芪丹參配伍提取物可改善MI心肌功能并抑制心肌重塑，繼續采用結扎冠狀動脈左前降支復制MI大鼠模型，以研究黃芪丹參配伍提取物在體內對MI的積極作用和機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD雄性8周齡大鼠(200±20 g)，購自河南省實驗動物中心(動物生產許可證號SCXK(豫)2015-0005，動物質量合格證號1001297)，晝夜12 h交替飼養7 d(溫度26 ℃±1 ℃、濕度55%±10%)。實驗動物及方案均按照《實驗動物護理和使用指南》[10]執行，并經南陽理工學院動物護理委員會的倫理準則批準進行(批準號：NYISTEEC-2017026)。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

實驗中藥材由南陽理工學院方藥研究所提供并鑒定蒙古黃芪干燥根經和唇形科植物丹參干燥根經，提取方法參照國家自然科學基金項目“黃芪丹參配伍提取物對心肌梗死后心室重構中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號傳導通路影響的研究(81173372)”，黃芪每克含原生藥33.36 g，黃芪總苷含量70.8%，丹參每克含原生藥17.32 g，丹參總酚酸含量65.6%。腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,Akt)、內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、兔抗多克隆抗體(Anti-GAPDH rabbit polyclonal antibody，GAPDH)(北京博奧森生物技術有限公司)；原位細胞死亡檢測試劑盒(福州市邁新生物技術開發公司)；HX-100E小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；動物超聲成像儀(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)；TKY-BMB石蠟包埋機、CUT6062病理切片機(深圳博大精科技實業有限公司)；熒光顯微鏡(DMIL-RF1，Leica,Germany)。

2 方法

2.1 建立MI大鼠模型

4%水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于動物手術臺。大鼠胸毛備皮消毒后，在胸骨上緣正中1 cm處縱切行氣管插管，接通呼吸機以輔助呼吸。胸骨左緣第三肋間心尖搏動處切口，鈍性依次分離肌層、胸膜，剪開心包膜后在左心耳右下緣中部和肺動脈圓錐部結扎。以肉眼可見心尖部顏色改變，心電圖顯示II導聯QRS波群增寬、ST段弓背抬高，確定MI大鼠模型復制成功。假手術組穿線不結扎，大鼠模型成功后胸腔進行分層封閉縫合，術后為預防感染連續3 d腹腔注射青霉素80萬單位。

2.2 分組及用藥

存活3 d的大鼠隨機分為黃芪丹參配伍提取物組[50 mg/(kg·d)]、假手術組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)各8只。尾靜脈注射給藥，連續3周后處死大鼠。

2.3 游泳疲勞時間

將大鼠置于自制水池中游泳(深度50 cm、面積1.5 m2、水溫30 ℃±1 ℃、)，游泳疲勞時間定義為大鼠在泳池中運動協調性降低，連續下沉3次以上。

2.4 超聲心動圖測量

在藥物干預的1、10、21 d采用30 MHz中頻掃描頭的高頻超聲系統評估心臟結構和功能。大鼠采用4%水合氯醛麻醉后，進行二維超聲心動圖測量，記錄左室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESd)、左室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室縮短分數(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

2.5 Masson染色法測量心肌纖維化

采集心臟后使用磷酸鹽緩沖液清洗，固定于4%多聚甲醛。在不同濃度酒精脫水后嵌入石蠟包埋切片4 μm厚度。參照Masson操作說明持續染色處理，依次蘇木素染色、伊紅染色、苯胺藍復染后脫水封片。染色后心肌樣本中肌纖維呈現紅色，膠原纖維呈現藍色。顯微鏡下成像，使用Image J軟件通過計算機平面測量法計算心肌纖維化。

2.6 酶聯免疫吸附(ELISA)法測定促炎因子

ELISA法檢測MI大鼠左心室心肌中TNF-α、TGF-β1、IL-1β的含量。取20 mg心肌樣品在200 μL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中均質后置于-20 ℃儲存過夜。進行凍融循環2次勻漿促使細胞膜破裂，5 000 r/min均速離心5 min后，按照試劑操作說明對樣品進行測定。

2.7 TUNEL染色法測定凋亡細胞

采用原位細胞死亡檢測試劑盒檢測Bax蛋白和B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的分布，心肌切片采用4’,6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(dihydrochloride,DAPI)溶液染色評估細胞核形態。在熒光顯微鏡下放大400倍對異硫氰酸熒光素標記的陽性細胞進行成像，在每片梗死邊緣區隨機選取3層，計算陽性細胞凋亡總數，采用Image Pro Plus軟件進行計算。

2.8 蛋白質印跡法(Western blot)分析

采用超聲、離心、熱變形等方法從MI大鼠左心室心肌組織中提取總蛋白。蛋白質溶解物在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳上電切分離后，轉移至硝化纖維素膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h后4 ℃冷藏用主要抗體培育過夜，包括兔抗Akt(1∶1 000)、兔抗磷酸Akt(1∶1 000)、兔抗eNOS(1∶1 000)、兔抗磷酸eNOS(1∶200)、兔抗NF-κB(1∶800)、兔抗Bax(1∶800)、兔抗Bcl-2(1∶800)、兔抗GAPDH(1∶1 000)。再將膜與辣根過氧化物酶結合的二級抗體(1∶500)置于室溫下孵育1 h后洗膜，采用超信號ECL化學發光試劑盒檢測。

2.9 統計分析

3 結果

3.1 MI模型大鼠游泳疲勞時間

與假手術組相比，模型組游泳一定時間后，運動協調性明顯下降，出現疲勞時間較早(P<0.01)。與模型組相比，經過中藥聯合干預后的黃芪丹參配伍提取物組游泳時對抗疲勞效果明顯，疲勞出現時間較晚(P<0.05)，如表1所示。

表1 各組MI大鼠游泳疲勞時間Table 1 Swimming fatigue time of MI rats in each

注：與假手術組相比**P<0.01，與模型組相比*P<0.05。

3.2 各組超聲心動圖觀察

經黃芪丹參配伍提取物干預后，超聲心動圖監測結果顯示該藥對組合可顯著改善MI大鼠心臟結構和心功能。在藥物干預1 d，黃芪丹參配伍提取物組和模型組心功能相比較無明顯差異。在21 d，與假手術組相比，模型組LVESd和LVEDd升高明顯，而LVEF和LVFS明顯降低；與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組LVEF和LVFS顯著增高，LVESd和LVEDd明顯降低，如圖1所示。

3.3 心肌纖維化觀察

經過Masson染色法檢測MI大鼠心肌纖維化表現，發現黃芪丹參配伍提取物可有效降低心肌纖維化。結果表明，假手術組紅色心肌組織排列較為規則清晰，心肌邊緣處伴有少量藍色膠原組織。與假手術組相比，模型組心肌組織排列明顯紊亂，膠原纖維增多并已取代部分紅色壞死心肌。與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組心肌排列整齊度占比較高，膠原纖維明顯減少，如圖2所示。

3.4 炎癥細胞因子表達

與假手術組相比，模型組中TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表達水平明顯升高(P<0.05)，說明心肌梗死后促炎細胞因子釋放增多。與模型組相比，TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表達顯著降低，有效抑制促炎細胞因子的釋放，有利于MI的愈后，如圖3所示。

3.5 心肌細胞凋亡測定

TUNEL染色后陽性細胞呈現綠色，經DAPI復染后細胞核藍色。與假手術組相比，模型組心肌邊緣區域凋亡細胞明顯增多(P<0.05)。與模型組相比，經中藥配伍聯合干預后的黃芪丹參配伍提取物組細胞凋亡顯著降低(P<0.05)。Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白含量結果顯示，與模型組相比，Bcl-2蛋白表達以及Bax/Bcl-2比例均顯著增加(P<0.05)，如圖4所示。

與模型組相比*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與假手術組相比++P<0.01、+++P<0.001、++++P<0.0001 圖1 各組MI大鼠超聲心動圖結果Fig.1 Echocardiographic results of MI rats in each group

3.6 Akt-eNOS信號表達

3組MI大鼠模型經Western blot法檢測Akt-eNOS蛋白表達較相似。但與假手術組相比，模型組磷酸化Akt和磷酸化eNOS蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，黃芪丹參配伍提取物組可有效增加Akt和eNOS的磷酸化(P<0.05)，如圖5所示。

4 討論

在本次實驗中，觀察了黃芪丹參配伍提取物對MI大鼠的心臟保護作用，得到以下結論。

(1)通過黃芪丹參配伍提取物干預后，可以提高MI大鼠的運動耐力，改善心肌結構，減輕心肌纖維化和炎癥水平。

圖2 各組MI大鼠心肌纖維化影像(×200)Fig.2 Imaging myocardial fibrosis ofMI rats in each group(×200)

(2)通過提高Bcl-2和降低Bax蛋白含量發揮細胞抗凋亡作用，有效增加Akt-eNOS的磷酸化。實驗結果表明，黃芪丹參配伍提取物能有效延緩MI后的心肌重塑進展。

與模型組相比*P<0.05，與假手術組相比+P<0.01、++P<0.01、+++P<0.001 圖3 各組MI大鼠促炎細胞因子水平Fig.3 Levels of proinflammatory cytokines of MI rats in each group

與模型組相比*P<0.05，**P<0.01 圖4 各組MI大鼠心肌細胞凋亡水平Fig.4 Apoptotic level of myocardial cells of MI rats in each group

與模型組相比*P<0.05 圖5 各組MI大鼠Akt-eNOS信號表達Fig.5 Akt-eNOS signal expression of MI rats in each group

炎癥細胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β在MI的心肌纖維化病理發展中起著關鍵作用。NF-κB是重要的轉錄因子，參與誘導促炎細胞、內皮黏附因子、氧化應激酶等多個靶基因的表達?；罨腘F-κB通過促進TNF-α、TGF-β1和IL-1β等表達激活心肌膠原纖維沉積，引發VR和HF，有研究報道通過抑制NF-κB能降低MI后的心肌損害[11]。在本次實驗中再次證實了MI后可誘導TNF-α、TGF-β1和IL-1β的含量有所增加，采用黃芪丹參配伍提取物干預后明顯降低這些炎性標志物的表達，說明黃芪丹參配伍提取物通過有效的抗炎作用有效保護心臟。心肌細胞的凋亡在MI和HF中起著重要作用，以往研究發現由缺血誘發的細胞凋亡導致自噬心肌細胞死亡以及心肌細胞在心肌缺血損傷過程中的丟失[12]。細胞凋亡主要特點是促凋亡Bax家族蛋白表達增加和抗凋亡Bcl-2家族蛋白表達減少，同時Bcl-2蛋白還可抑制轉錄因子NF-κB活性，說明細胞凋亡的擴增會引發纖維化表現，心肌細胞的凋亡在心肌纖維化發展中起著重要作用。本次實驗研究顯示，黃芪丹參配伍提取物可顯著降低MI模型大鼠心肌邊緣區細胞凋亡水平，此外還能有效上調Bcl-2蛋白并抑制Bax蛋白表達，表明黃芪丹參配伍提取物可通過對抗細胞凋亡減少心肌重塑。一氧化氮(NO)是參與血管內皮細胞生成的重要因子之一，eNOS作為維護血管內皮功能穩定的標志，在維持血管內皮完整性、血管舒張性和血管生成中具有重要作用。Akt和eNOS磷酸化通路途徑的激活能積極促進NO的合成，通過調節血管重構和血管生成保護心肌缺血再灌注損傷[13]，如eNOS缺乏則可引起心肌細胞凋亡引發心力衰竭。本次實驗研究觀察到黃芪丹參配伍提取物可明顯誘導MI大鼠模型心肌組織中Akt和eNOS磷酸化，表明通過該中藥組合配伍干預后可通過激活Akt/eNOS通路對缺血性心肌組織產生積極的保護作用。

綜上所述，本次實驗研究表明黃芪丹參配伍提取物可有效預防MI后的心肌重塑，其潛在機制可能與抗炎、抗纖維化、對抗細胞凋亡和維護血管內皮功能穩定性有直接關系。實驗中使用黃芪丹參配伍提取物顯著改善了MI模型大鼠左心室形態結構和功能，但仍存在觀察周期較短，能否聯合其他藥物方法配伍使用，尚需進一步觀察揭示更多的作用途徑。鑒于黃芪丹參配伍對缺血性心肌的保護作用認識不斷加深，此藥將作為新的治療方法繼續深入研究。