胰蛋白酶的純化及質量研究

汪雅雯 王欣 黃臻輝

摘 要 目的：建立一種胰蛋白酶的純化方法，并進行質量研究。 方法：胰蛋白酶原（粗品）經溶解、低pH孵放法滅活病毒、超濾除鹽、酶原活化、親和層析純化、洗脫液超濾除鹽、膜過濾法去除病毒和真空冷凍干燥等工序，即得胰蛋白酶。 結果：所獲的胰蛋白酶符合藥典規定的限度要求。結論：該方法可縮短生產工時、提高成品效價和工藝穩定性，降低糜蛋白酶含量，提升了胰蛋白酶的質量和安全性。

關鍵詞 胰蛋白酶 純化 質量

中圖分類號：TQ464.8； TQ460.64 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）11-0089-04

Study on purification and quality of trypsin

WANG Yawen*， WANG Xin， HUANG Zhenhui

（SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To prepare high-purity trypsin and investigate its quality. Methods： The manufacturing process for the production of trypsin included dissolving trypsinogen （crude extract）， inactivating virus by incubation at low pH value， desalinating by ultra-filtration， trypsinogen activating， purification by affinity chromatography， eluent desalinating by ultrafiltration， virus removal by nano-film filtration and vacuum freeze-drying. Results： The prepared trypsin could reach to the standard of pharmacopeia. Conclusion： The production cycle can be shortened， the potency of trypsin and the stability of the process can be improved， the content of chymotrypsin can be reduced and the quality and safety of trypsin can be increased.

KEy WORDS trypsin； purification； quality

胰蛋白酶（trypsin，EC3.4.21.4）屬于絲氨酸蛋白酶家族[1]，為特異性肽鏈內切酶，可選擇性地切斷賴氨酸和精氨酸殘基羧基端形成的肽鍵。胰蛋白酶主要來源于豬、?；蜓虻囊扰K，經分離純化所得。

牛胰蛋白酶是由223個氨基酸組成的單一肽鏈，含6對二硫鍵，分子量約為23 800 Da[2]。目前胰蛋白酶生產工藝多采用硫酸銨鹽析法，此工藝純化能力弱，耗時長、成品效價低，且有關物質糜蛋白酶含量易超出限度要求。另外，鑒于胰蛋白酶原粗品來自動物臟器，存在病毒感染的風險，會對終產品臨床應用的安全性構成一定的威脅。因此，極有必要開發一種能克服現有技術缺陷的制備工藝。親和層析純化胰蛋白酶，工藝較為簡便，工時較短，可得到高純度、高效價的成品；在制備過程中增加病毒滅活/去除工序，進一步提高了產品的質量和安全性。本研究以提取過糜蛋白酶的牛胰濾液經鹽析所得的胰蛋白酶原（粗品）為原料，經溶解、低pH孵放法滅活病毒、超濾除鹽、酶原活化、親和層析純化、洗脫液超濾除鹽、膜過濾去除病毒和真空冷凍干燥等工序獲得胰蛋白酶[3]。同時嚴格按照國內外藥典標準[4-6]進行檢測，分子排阻色譜法分析純度，進一步控制產品質量，保證產品的安全性。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

Benzamidine Sepharose 4FF（HS）和AKTA（GE Healthcare公司）；FE20 pH計、S230電導率儀和XS205分析天平（Mettler Toledo公司）；中空纖維膜柱和Microza-Table超濾儀（Pall公司）；MIR-254低溫恒溫培養箱（Panasonic公司）；UV-2450紫外-可見分光光度計（Shimadzu公司）；JJ2000電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；LC-6M離心機（上海市離心機械研究所有限公司）；BPZ-6033真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；YB-2澄明度檢測儀（天大天發科技有限公司）；SX2-2.5-12TP箱式電阻爐（上海躍進醫療器械有限公司）；ZHJH-C1118B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；GSP-9270MBE隔水式恒溫培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；（0.45 mm+0.2 mm）囊式過濾器、（0.2 mm+0.1 mm）囊式過濾器和Virosart CPV病毒過濾器（Sartorius Stedim公司）；TSKgel G2000SWXL柱（7.8 mm×300 mm，5 μm， Tosoh公司）；e2695/2489液相色譜儀（Waters公司）。

胰蛋白酶原粗品購自集寧區牛羊臟器加工部；胰蛋白酶由上海上藥第一生化藥業有限公司自制；N-乙酰-L-酪氨酸乙酯購自Sigma公司；核糖核酸酶A對照品、人胰島素對照品、胸腺法新對照品、生長抑素對照品購自中國食品藥品檢定研究院；BCA蛋白質定量檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為國產試劑。

1.2 實驗方法

制備工藝流程見圖1。

1.2.1 粗品溶解

稱取胰蛋白酶原粗品1 000 g，加入5倍量（V/W）酸性水溶液（用2.5 mol/L H2SO4調節純化水至pH 2.8～3.2）攪拌，直至全部溶解。

1.2.2 病毒滅活

粗品溶液于20～25 ℃孵放60 min。在此條件可使病毒表面的細胞抗原電荷發生改變，蛋白質的空間結構發生不可逆變性，從而使病毒喪失與細胞受體結合的能力，不能進入細胞完成侵染[7]，達到滅活病毒的目的。

1.2.3 超濾除鹽

病毒滅活后的粗品溶液，于4 ℃、4 000 r/min的條件下離心15～20 min，取上清液，加入等體積pH 3.0水溶液，用截留分子量為10 kDa的中空纖維膜柱超濾除鹽至1/2體積；補加等體積pH 3.0水溶液，超濾至1/2體積；重復以上操作，直至電導率降至5 ms/cm以下，降低高鹽對胰蛋白酶原活化的影響。親和層析純化后，用截留分子量為6 kDa的中空纖維膜柱再次超濾除鹽，直至電導率降至1.5 ms/cm以下。兩次超濾除鹽后溶液的終體積均約為5～6 L。

1.2.4 酶原活化

待超濾除鹽后，加5 mol/L CaCl2溶液至終濃度為100 mmol/L。用5 mol/L NaOH調節至pH 7.3～7.6，按1/1 000倍量粗品加入胰蛋白酶1.0 g（W/W），攪拌溶解后于0～10 ℃活化。每小時取樣，參照《中國藥典》2015年版（二部）“胰蛋白酶”質量標準中“效價”[4]檢測溶液效價；待液體效價無顯著增長時結束活化，測定蛋白濃度，計算活化液的比活。

1.2.5 親和層析純化

預先將親和層析填料Benzamidine Sepharose 4FF（HS）裝柱。用Tris-HCl（pH 7.3～7.6，50 mmol/L）、NaCl（150 mmol/L）、CaCl2（100 mmol/L）緩沖液作為平衡液進行平衡；上樣前活化液須經深層過濾器和（0.45 mm+0.2 mm）囊式過濾器壓濾處理；上樣完畢，用平衡液洗柱，直至流穿峰A280nm下至基線；用NaCl溶液（pH 2.0，500 mmol/L）洗脫，收集洗脫液。其中上樣、洗柱和洗脫的流速均為200 ml/min。測定洗脫液的蛋白濃度和效價，計算洗脫液的比活。

1.2.6 病毒去除

將上述超濾除鹽后所獲的溶液用5 mol/L NaOH調節至pH 5.9～6.1，4層中速濾紙抽濾得濾液。濾液于0～10℃經（0.45 mm+0.2 mm）-（0.2 mm+0.1 mm）-Virosart CPV病毒過濾器三聯膜、2 Bar壓力下壓濾。Virosart CPV為納米膜，利用蛋白質和病毒的大小差異來分離病毒[7]，達到去除病毒的目的。

1.2.7 真空冷凍干燥及分析檢測

將胰蛋白酶濾液冷凍干燥，經前后箱制冷、抽真空、一次升華、二次升華、保溫，出箱得胰蛋白酶成品。

根據《中國藥典》2015年版（二部）“胰蛋白酶”質量標準[4]進行胰蛋白酶成品的全項測定。同時依據《美國藥典》42版（USP42）和《英國藥典》2019（BP2019）中“胰蛋白酶”質量標準，新增吸收系數、組胺（可反映胰蛋白酶中有機雜質含量）[5]、熾灼殘渣（可反映無機雜質含量）[6]、微生物（可反映外源因子污染）[5-6]的檢測，進一步控制成品的質量，保證產品的安全性。

取核糖核酸酶A（分子量13 700 Da）對照品、人胰島素（分子量5 808 Da）對照品、胸腺法新（分子量3 108 Da）對照品、生長抑素（分子量1 638 Da）對照品，加流動相溶解制成每1 ml中含1 mg的溶液，作為分子量對照溶液；流動相為三氟乙酸-乙腈-水（0.5∶350∶650）；檢測波長280 nm，流速1 ml/min，柱溫30 ℃。 取對照溶液20 ml，注入液相色譜儀，以各峰保留時間為橫坐標，分子量對數為縱坐標，進行線性回歸。取胰蛋白酶成品溶解液20 ml，注入液相色譜儀，按面積歸一化法計算分子量大于10 000 Da的蛋白的比例，作為胰蛋白酶純度的檢測。

2 結果

2.1 親和層析純化效果評估

對活化液和洗脫液進行效價（活性）、蛋白濃度的測定及比活的計算，以評估純化的效果（純化倍數），結果如表1所示。親和層析的純化倍數為1.9，活性回收率為76.6%。

2.2 純化產品測定

胰蛋白酶冷凍干燥后得固體粉末82.4 g。胰蛋白酶性狀、鑒別、酸度、溶液澄清度、干燥失重、糜蛋白酶和效價等檢測結果均符合《中國藥典》各項的限度要求；吸收系數、組胺、熾灼殘渣和微生物等檢測結果均符合《美國藥典》和《英國藥典》規定的限度要求（表2）。胰蛋白酶收率為3.21億U/kg，分子排阻色譜法檢測純度達90.0%（圖2）。

3 討論

本制備工藝的優勢主要包括以下幾方面：①親和層析法取代硫酸銨多次鹽析，縮短了生產工時；②超濾工序可實現單元操作管道化和自動化；③提高了成品效價：《中國藥典》2015年版“胰蛋白酶”[4]限度要求不得<2 500 U/mg，此制備工藝所得的效價約為4 000 U/mg，顯著提高了產品的質量；④降低糜蛋白酶含量：有關物質糜蛋白酶是牛胰臟中理化性質和胰蛋白酶非常相近的雜蛋白；在親和純化條件下，牛源糜蛋白酶不能與Benzamidine結合，確保了胰蛋白酶成品中糜蛋白酶含量合格，且遠低于藥典規定的“每2 500 U胰蛋白酶中不得多于50 U的糜蛋白酶[4]”；⑤胰蛋白酶質量符合美國藥典和英國藥典的質量標準；⑥傳統工藝中硫酸銨鹽析法受蛋白質濃度等多個因素影響較大，因而得到的成品質量批次間差異較大，而親和層析法可減少胰蛋白酶原粗品的質量影響，提高工藝穩定性；⑦針對潛在污染病毒的威脅并結合胰蛋白酶低溫、低pH穩定的特性，增加低pH孵放法滅活病毒和膜過濾法去除病毒；兩種有效工序從機制上可互補，進一步提升了產品的質量和安全性。

按照上述的制備工藝可得高質量的胰蛋白酶，但是制備過程中中間體研究還待細化，明確關鍵工藝參數，以達到生產過程控制的目的；同時鑒于胰蛋白酶在低溫條件比較穩定，可預冷親和層析的緩沖液，提高胰蛋白酶的穩定性，提高回收率；加強胰蛋白酶原粗品的質量控制，減少動物組織提取制品普遍存在的批次間差異大的問題。

親和層析具有吸附洗脫速率快、色譜柱壓較低、生產規模容易按比例放大等多項優點[8]。但鑒于親和層析填料價格昂貴，如何提高填料的重復利用率，還有待進一步摸索。

參考文獻

[1] Rawlings ND， Barrett AJ. Families of serine peptidases[J]. Methods Enzymol， 1994， 244： 19-61.

[2] Ohshima Y， Suzuki Y， Nakatani A， et al. Refolding of fully reduced bovine pancreatic trypsin[J]. J Biosci Bioeng， 2008， 106（4）： 345-349.

[3] 黃臻輝， 汪雅雯， 周偉潔， 等. 一種高純度胰蛋白酶的制備方法： CN104762284A[P]. 2015-07-08.

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版二部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 1169-1170.

[5] British Pharmacopoeia Commission. BP2019[EB/OL].[2019-10-12]. https：//www.pharmacopoeia.com/bp-2019/monographs/trypsin.html？published-date=2018-08-01&text=trypsin.

[6] The United States Pharmacopeial Convention. USP42-NF37[EB/OL]. [2019-10-12]. https：//online.uspnf.com/ uspnf/document/GUID-F4F923EE-11B8-4069-829F-39BB0E2C4625_1_en-US？highlight=trypsin.

[7] 宋清爽， 吳恩應， 張運佳， 等. 血液制品病毒滅活及去除工藝進展[J]. 生物技術通訊， 2012， 23（4）： 627-630.

[8] 安小寧， 高崴. 磁性親合分離法純化胰蛋白酶[J]. 現代食品科技， 2007， 23（11）： 37-40.