生防地衣芽孢桿菌最佳發酵條件探究

徐亞英 黃曉梅 謝麗

摘 要 通過單因素試驗對地衣芽孢桿菌發酵培養基配方及條件進行優化。結果表明，該菌菌株培養基最佳配比為蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%，最佳培養條件是初始pH值8.5、溫度37 ℃、時間36 h、三角瓶裝液量125 mL、接種量4%、轉速200 r·min-1。該研究為地衣芽孢桿菌的大規模工業化發酵培養提供了有益借鑒。

關鍵詞 地衣芽孢桿菌;發酵條件優化;單因子試驗

微生物制劑是現在各國競相研究開發的新產品。我國原農業部于2003年就公布了可用于生產微生態制劑的芽孢桿菌屬菌種有地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等。地衣芽孢桿菌是一種益生菌，是革蘭氏陽性好氧菌，化能異養，在一定條件下能產生抗逆性內生孢子[1-3]。近年來，國內外對于地衣芽孢桿菌各方面應用的報道日益增多，是芽孢桿菌中具有較大應用前景的菌種之一，在醫藥、農藥、飼料加工等行業中都取得了較好的研究成果[4-6]。但該桿菌在動物微生態制劑及植物病蟲害防治方面的應用仍處于發展階段，發展潛力較大。尤其是在植物微生態制劑上的應用，具有重要的發展意義。

地衣芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，是植物及土壤微生態的優勢種群;能分泌抑制或者殺死病原菌的次級代謝產物，對許多植物的病原菌有較好的抑制作用，如對核盤菌、鐮刀菌、水稻紋枯病病菌和稻瘟病病菌等均具有較好的抑菌作用，具有較好的生防潛力，已經成功用在植物病害的生物防治方面[7-10]。目前，登記的相關農藥制劑為地衣芽孢桿菌水劑，由廣西金燕子農藥有限公司研制，含80億個/mL活芽孢，主要防治黃瓜保護地的霜霉病。但在將地衣芽孢桿菌制成微生態制劑時，保證含有大量的細胞、芽孢且成本較低是一個重要前提[11]。基于此，采用單因素試驗研究不同發酵培養基及不同培養條件對地衣芽孢桿菌培養的影響，以期為降低地衣芽孢桿菌高密度培養的成本提供一定的理論依據，使其能夠滿足微生物菌劑的生產要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

地衣芽孢桿菌由黑龍江農業職業技術學院分析檢測中心微生物試驗室篩選保存;可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、麥芽糖、酵母提取物、硫酸鎂、牛肉膏、尿素、硫酸銨、氯化銨、氯化鈉、氯化鈣和磷酸二氫鉀等均為分析純試劑。

種子培養基與基礎發酵培養基均是LB培養基，即蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，自然pH。

主要設備有紫外-可見分光光度計、高壓蒸氣滅菌鍋、生化培養箱、恒溫培養振蕩器、pH計、精密電子天平、無菌操作臺等。

1.2 試驗設計

1.2.1 培養方法

1.2.1.1菌種活化

將保存菌種轉接至LB固體培養基上，37 ℃培養至24 h待用。

1.2.1.2種子液制備

挑取已活化的單菌落接種到含50 mL液體培養基的三角瓶中，160 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養16～18 h后待用。

1.2.1.3搖瓶培養

分別取一定量的種子液，按2%的接種量接至含培養基的三角瓶中;在200 r·min-1、37 ℃搖床中培養36 h，進行單因素試驗的發酵培養研究。

1.2.2 培養基配方優化試驗設計

1.2.2.1碳源

分別用5 g·L-1的酵母粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、麩皮和可溶性淀粉等量取代基礎培養液的碳源。使用搖瓶發酵培養，36 h后通過測定發酵液的活菌數來確定最佳碳源。

1.2.2.2氮源

依次用10 g·L-1的豆粉、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、硝酸銨、尿素和氯化銨替代基礎發酵液的氮源。使用搖瓶發酵培養，36 h后通過測定發酵液的活菌數來確定最佳氮源。

1.2.2.3無機鹽

依次用10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4和KCl等量替代基礎發酵液的無機鹽。采用搖瓶發酵培養，36 h后通過測定發酵液的活菌數來確定最佳無機鹽種類。每個處理3次重復，其他發酵條件同1.2.1.3。

1.2.3 培養條件優化設計

使用篩選出的最佳培養基配方，先固定搖瓶培養的其他發酵條件，對初始pH、裝液量、溫度、接菌量、發酵時間等發酵條件進行優化。初始pH值依次調為5.5、6.5、7.5、8.5和9.5;接種量分別調為裝液量的1%、2%、4%、5%、6%和8%;在250 mL三角瓶中分別裝入25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL和150 mL發酵培養液;發酵時間分別設為12 h、24 h、48 h和60 h;溫度分別設為30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃;轉速分別設為100 r·min-1、150 r·min-1、200 r·min-1、220 r·min-1和250 r·min-1。每處理3次重復，其他發酵條件同1.2.1.3。

1.3 測定方法

以空白培養基為對照，菌體發酵液的測定采用比濁法，即發酵液10～15 mL在2 000 r·min-1下離心2 min，測定菌液的OD600值（溶液在600 nm波長處的吸光值），pH計測定菌液pH。

2 結果與分析

2.1 培養基優化

2.1.1 碳源

分別對不同碳源進行篩選，其他組分均相同進行發酵。通過試驗可知，地衣芽孢桿菌生長的最佳碳源是酵母提取物，其次是麩皮。

2.1.2 氮源

試驗對培養基的氮源進行了優化。結果發現，胰蛋白胨作為氮源，能大大促進地衣芽孢桿菌的生長，效果明顯好于其他氮源，牛肉膏對地衣芽孢桿菌的生長影響不大，因此該桿菌生長的最適氮源是胰蛋白胨，這可能與胰蛋白胨含有較多的維生素、氨基酸和未知生長因子等有關。

2.1.3 無機鹽

在上述最適碳源和氮源的基礎上，分別對不同的無機鹽進行篩選。結果表明，當使用原基礎培養基中的無機鹽進行培養時，地衣芽孢桿菌的OD600值最大，其次是CaCl2·2H2O。所以，地衣芽孢桿菌發酵培養基的最適無機鹽仍為氯化鈉。

2.2 發酵條件優化

2.2.1 初始pH

試驗在配制了最佳培養基后，分別對不同pH進行測定。由試驗可知，在初始pH值為5.5～8.5時，地衣芽孢桿菌發酵液OD600值隨pH值的增加而增加，但初始pH值為8.5時的發酵液的OD600值最大，當培養液初始pH值大于8.5時，發酵液OD600值開始明顯下降，且與初始pH 8.5的OD600值呈現顯著性差異。因此，地衣芽孢桿菌最適初始pH值為8.5左右。

2.2.2 接種量

分別對不同接種量進行篩選，發現地衣芽孢桿菌生長的最適接種量為4%。在接種量為1%～4%時，隨著接種量的增加，其發酵菌液OD600值略有升高，接種量>4%后，發酵液OD600值開始略有下降。

2.2.3 裝液量

在搖瓶發酵的培養條件下培養至36 h，用比濁法測定發酵液OD600值。由試驗可知，125 mL裝液量的培養基內OD600值最大，隨著裝液量增大，活菌數具有下降趨勢。

2.2.4 培養時間

最佳培養基的裝液量為125 mL/250 mL、初始pH值調至8.5、接種量為4%時，測定不同搖菌時間對發酵液活菌數的影響。由試驗可知，隨著搖菌時間的增加，其OD600值也在增加，至36 h，OD600值為最大;隨著培養時間的延長，36 h后含菌數逐漸減少，OD600值逐漸變小，地衣芽孢桿菌至生長衰亡期。因此，36 h為較合適的搖菌時間。

2.2.5 溫度

在發酵培養的條件下培養至36 h，測定OD值。通過試驗可知，該桿菌在37～45 ℃都能良好生長，故地衣芽孢桿菌生長的最適溫度為37 ℃。

2.2.6 轉速

分別測定不同轉速對發酵液活菌數的影響。由試驗可知，隨著轉速的提高，OD600值升高;轉速超過200 r·min-1后，其OD600值反而下降。因此地衣芽孢桿菌的最適培養轉速為200 r·min-1。

3 結論

試驗表明，培養基成分配比與發酵條件均對地衣芽孢菌株的生長有較大影響。通過單因素試驗確定地衣芽孢桿菌的優化培養基為5 g·L-1酵母提取物、胰蛋白胨10 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，最適發酵條件為初始pH 8.5、發酵溫度為37 ℃、發酵時間36 h、搖床轉速200 r·min-1、接種量為4%。該研究為地衣芽孢桿菌的大規模工業化發酵培養提供了有益借鑒。

參考文獻：

[1] 王居亮，王一，韓翠蘋.一株枯草芽孢桿菌的分離及培養基的優化[J].輕工科技，2016（9）：16-18.

[2] 張莉力，許云賀，肖海蒂，等.地衣芽孢桿菌BL-5產孢發酵條件優化[J].食品工業科技，2017，38（3）：150-155.

[3] 朱天輝，李姝江，向瀟瀟，等.地衣芽孢桿菌YB15發酵培養優化的研究[J].四川林業科技，2013，34（1）：1-3.

[4] Ranjit K N，Raman R，Jadhao S，et al.Effect of dietary supplementation of Bacillus licheniformis on gut microbiota， growth and immune response in giantfreshwater prawn， Macrobrachium rosenbergii（de Man， 1879）[J].Aquaculture International，2013，21（2）：387-403.

[5] 劉陽，譚明，潘寶平，等.一株地衣芽孢桿菌的性質研究及發酵培養基優化[J].安徽農業科學，2012，40（3）：1348-1351.

[6] Batrakov S G，Rodionova T A，Esipov S E，et al.A novel lipopeptide， an inhibitor of bacterial adhesion， from the thermophilic and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis strain 603[J].Molecular and Cell Biology of Lipids，2003，1634（3）：107-115.

[7] Ahmed S A，Ezziyyani M，Sanchez PC，et al.Effect of chitin on biological control activity of Bacillus spp. and Trichoderma harzianum against root rot disease in pepper （Capsicum annuum） plants[J].European Journal of Plant Pathology，2003，109（6）：633-637.

[8] 紀明山，王毅婧.地衣芽孢桿菌生防菌株SDYT-79發酵條件優化[J].沈陽農業大學學報，2011，42（2）：164-169.

[9] 唐娟，張毅，李雷雷，等.地衣芽孢桿菌應用研究進展[J].湖北農業學，2008，47（3）：351-354.

[10] 付維來，杜建濤，劉鵬.地衣芽孢桿菌M109高密度發酵條件的優化[J].中國畜牧獸醫，2012，39（11）：215-219.

[11] 豐貴鵬，楊麗云.地衣芽孢桿菌發酵培養基的優化[J].安徽農業科學，2009，37（15）：6862-6864.

（責任編輯：劉昀）