長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA對(duì)胰腺癌診斷的臨床價(jià)值

陳艷紅 孫麗 劉艷 張雙雙 祖蓓蓓 牛國(guó)平

江蘇省徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，徐州 221009

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上，具有在人體內(nèi)參與細(xì)胞的發(fā)育、成熟、增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)功能[1]。HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA(HOXA distal transcript antisense RNA, HOTTIP)是從HOXA家族中轉(zhuǎn)錄出來(lái)的一種lncRNA，參與多種疾病的生物學(xué)調(diào)控過(guò)程[2]。研究表明，HOTTIP與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]，在胰腺癌中也有異常表達(dá)[5]，但目前尚未明確血漿HOTTIP對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。本研究分析HOTTIP在胰腺癌患者癌組織及血漿中表達(dá)的意義，探討HOTTIP對(duì)胰腺癌診斷的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2017年6月至2018年12月間徐州市中心醫(yī)院18例行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常胰腺組織(距癌病灶>1 cm)，其中男性患者12例，女性6例，平均年齡62歲。收集78例臨床確診的胰腺癌患者血漿，其中男性53例，女性25例，平均年齡61歲；收集78例健康體檢者作為健康對(duì)照組，其中男性50例，女性28例，平均年齡57歲；收集原發(fā)性肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者各50例作為疾病對(duì)照組。所有患者及健康體檢者均未接受放療、化療及免疫治療，且無(wú)其他基礎(chǔ)病史。本研究經(jīng)徐州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

胰腺癌組織及癌旁組織在離體15 min內(nèi)收集，組織剪碎后用膠原酶消化，置液氮保存待用。各組患者入院2 h內(nèi)靜脈采血5 ml，EDTA-K2抗凝，立即4℃ 500×g離心10 min，然后4℃ 12 000×g繼續(xù)離心10 min，分離上層血漿，置-80℃保存待用。

二、胰腺癌組織HOTTIP及各組患者血漿HOTTIP、CA19-9水平檢測(cè)

取液氮保存的組織標(biāo)本及-80℃保存的待檢血漿，加入Trizol裂解，按照總RNA提取試劑盒(美國(guó)Applied BioSystems公司)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，使用PCR試劑盒(大連寶生物工程公司)分別進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄和目的片段的擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。HOTTIP正向引物序列為5′-CACACTCACATTCGCACACT-3＇，反向引物序列為5′-TCCAGAACTAAGCCAGCCATA-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 10 s、62℃ 30 s、72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)儀器自帶軟件獲取Ct值，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算HOTTIP表達(dá)量。

采用電化學(xué)發(fā)光法(德國(guó)Roche Cobas e602)檢測(cè)胰腺癌患者血漿CA19-9水平。

三、隨訪

所有患者術(shù)后均進(jìn)行5年隨訪，隨訪方式為復(fù)診及電話回訪。術(shù)后1～2年每1個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，術(shù)后3～5年每3個(gè)月進(jìn)行1次回訪。總生存期為隨訪開(kāi)始至最后一次回訪或患者死亡時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織及各組患者血漿HOTTIP水平的比較

胰腺癌患者癌組織HOTTIP表達(dá)量顯著高于相應(yīng)癌旁正常胰腺組織(2.24±0.25比0.62±0.11，t=6.86，P<0.001)；胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者及健康對(duì)照者血漿HOTTIP水平分別為1.33±0.32、0.57±0.17、0.51±0.10、0.41±0.09、0.54±0.05，胰腺癌組顯著高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.58、7.13、8.66、7.25，P值分別<0.05、<0.001、<0.001、<0.001)，但肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者血漿HOTTIP水平與健康對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.59、0.26、0.37，P值分別為0.55、0.79、0.52)，提示HOTTIP對(duì)肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者無(wú)診斷價(jià)值。

二、胰腺癌患者血漿HOTTIP與CA19-9水平及癌組織HOTTIP表達(dá)的相關(guān)性分析

胰腺癌患者血漿HOTTIP表達(dá)水平為1.33±0.32，CA19-9水平為(659.8±425.9)U/ml，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.43，P<0.001，圖1A)；胰腺癌患者血漿HOTTIP水平與胰腺癌組織HOTTIP表達(dá)量也呈正相關(guān)(r=0.58，P<0.001，圖1 B)。

注：HOTTIP為HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA；CA19-9為糖鏈抗原19-9圖1 胰腺癌患者血漿HOTTIP與CA19-9(1A)及癌組織HOTTIP(1B)的相關(guān)性分析

三、胰腺癌患者血漿HOTTIP水平與臨床病理特征、生存率的關(guān)系

根據(jù)血漿HOTTIP水平的中位數(shù)將78例胰腺癌患者分為HOTTIP高表達(dá)組和低表達(dá)組，各39例。胰腺癌患者血漿HOTTIP水平與TNM分期明顯相關(guān)，而與患者性別、年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(表1)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，HOTTIP高表達(dá)組胰腺癌患者的生存率明顯低于低表達(dá)組(15.9個(gè)月比30.6個(gè)月，χ2=4.36，P=0.035，圖2)。

四、胰腺癌患者血漿HOTTIP水平對(duì)胰腺癌的診斷效能

胰腺癌患者血漿HOTTIP診斷胰腺癌的AUC值為0.81(95%CI0.74～0.87)，約登指數(shù)為0.56，診斷臨界值為1.14，診斷靈敏度為62%(48/78)，特異度為94%(73/78)，準(zhǔn)確性為74%(58/78)。CA19-9診斷胰腺癌的AUC值為0.72(0.63～0.80)，約登指數(shù)為0.49，靈敏度為65%(51/78)，特異度為84%(66/78)，準(zhǔn)確性為71%。二者聯(lián)合診斷的靈敏度為81%(6/78)，特異度為97%(76/78)，準(zhǔn)確性為84%(66/78)，提示聯(lián)合檢測(cè)HOTTIP和CA19-9能提高診斷胰腺癌的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確性(圖3)。

討 論

lncRNA在細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)甚至轉(zhuǎn)移以及耐藥等方面均發(fā)揮不同的作用[6]。HOTTIP最初由Wang等[7]發(fā)現(xiàn)于人末梢組織成纖維細(xì)胞，位于7號(hào)染色體短臂1區(qū)。HOTTIP不僅可作為分子信號(hào)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，還可作為分子引導(dǎo)，特異性連接并募集混合系白血病復(fù)合體/WD重復(fù)蛋白5復(fù)合物，激活HOXA基因并轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

表1 胰腺癌患者血漿HOPPIT表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(例)

臨床病理特征例數(shù)HOPPIT表達(dá)低高χ2值P值性別5.1650.360 男532924 女251015年齡0.2190.590 <60歲261511 ≥60歲5224 28淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3.0920.070 N0351520 N1291316 N214113TNM分期11.2650.029 Ⅰ期271611 Ⅱ期352114 Ⅲ期16214腫瘤大小(cm)3.8060.754 <2.0451332 ≥2.0331320

注：HOPPIT 為HOXA 末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA

注：HOTTIP為HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA圖2 胰腺癌患者血漿HOPPIT水平與生存率的關(guān)系

注：HOTTIP為HOXA末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA；CA19-9為糖鏈接原19-9圖3 胰腺癌患者血漿HOTTIP及CA19-9診斷胰腺癌的ROC曲線

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中HOTTIP的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)胰腺癌患者血漿中HOTTIP水平較健康對(duì)照者及肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌患者血漿HOTTIP水平與健康對(duì)照者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HOTTIP診斷胰腺癌具有較高的特異性。本研究結(jié)果還顯示，胰腺癌患者血漿HOTTIP與CA19-9水平呈正相關(guān)。聯(lián)合應(yīng)用血漿HOTTIP和CA19-9診斷胰腺癌可以將靈敏度從62%提高到81%，特異度從94%提高到97%，表明血漿HOTTIP有望成為臨床診斷胰腺癌的有潛能的腫瘤標(biāo)志物。

本研究也存在樣本選擇偏倚、僅限于橫斷面的研究等不足之處，仍需多中心、大樣本進(jìn)一步證實(shí)HOTTIP在胰腺癌中的作用機(jī)制及對(duì)胰腺癌診斷的臨床價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突