SMA 小鼠中相關剪接因子表達與SMN2 外顯子7 列入比率關系研究

杜利莉,馬 鈺,柏文清,吳劉成,邵義祥*

(1.南通大學神經再生重點實驗室,江蘇 南通 226001； 2.南通大學實驗動物中心,江蘇 南通 226001；3.南通大學杏林學院,江蘇 南通 226001)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是由運動神經元生存1(survival of motor neuron1,SMN1)基因遺傳缺陷引起,SMN1 基因編碼SMN 蛋白,廣泛表達于所有真核細胞,為運動神經元存活所必需。 較低水平的蛋白質導致脊髓前角運動神經元細胞功能喪失,隨后全身骨骼肌萎縮,其他身體系統也可能受到影響,特別是早期發病的患者。SMA 是嬰兒死亡最常見的遺傳原因[1-2]。

SMA 的致病基因SMN1 是位于5q13 的基因,患者常因其外顯子7 和8 或僅外顯子7 同源缺失,從而導致不能表達有功能的全長SMN 蛋白[3]。 而人類的SMN1 基因在這個重復片段區域還存在唯一與之高度同源的SMN2 基因,兩者的關鍵不同之處在于外顯子7 第6 位核苷酸由SMN1 中的C 轉變為SMN2 中的T,雖然沒有造成翻譯中氨基酸的改變,卻嚴重影響了該外顯子列入(exon inclusion)[4]。SMN2 的成熟轉錄產物約90%不包含外顯子7,而沒有外顯子7 的蛋白(稱作SMNΔ7)基本沒有功能且極不穩定[5]。 是否能夠通過增強SMN2 外顯子7 的保留來獲得全長(full-length,FL)的SMN,從而有效降低SMA 患者的臨床癥狀? 這個問題為研究者所關注,有望使SMN2 成為治療SMA 的理想靶點[6]。僅含有Smn 基因一個拷貝的小鼠,由于轉入人的SMN2 基因能夠挽救其Smn 純合子敲除的胚胎致死性并延遲至出生后10 d 左右死亡,且癥狀與人類Ⅰ型的SMA 相似[7],從而使得SMA 小鼠成為目前國際相關領域公認的良好模型。 故在SMA 小鼠中,通過研究SMN2 剪接來獲得全長SMN 蛋白,從而觀察SMA 小鼠的病情及壽命是否有所改善,探討脊髓性肌萎縮癥有效的臨床治療方案,是當前國際SMA 研究關注的焦點。 本實驗通過研究SMA Ⅰ型小鼠不同組織中SMN2 外顯子7 列入與相關剪接因子的表達差異,篩選與SMN2 外顯子7 列入具有密切關系的剪接因子,以期待發現可能參與SMA 相關基因SMN2 剪接的新調控因子,為SMA 疾病的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2 只雌性SMA Ⅲ型小鼠(基因型Smn-/-SMN22tg/2tg),1 只雄性雜合子Smn 敲除小鼠(基因型Smn+/-),6 周齡,體重18 ～22 g,用以交配繁殖。SMA Ⅰ型小鼠(基因型Smn-/-SMN22tg/0)、SMA Ⅰ型對照小鼠(基因型Smn+/-SMN22tg/0),4 d 齡,體重1～4 g,雌雄不限,各4 只,用以進行實驗。 小鼠背景品系均為SPF 級FVB 近交系小鼠,均來源于南通大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2014-0001]并在南通大學實驗動物中心SPF 級屏障環境飼養繁殖。 動物實驗在南通大學實驗動物中心比較醫學實驗室進行[SYXK(蘇)2017-0046]。 實驗動物的使用堅持3R 原則,且所有動物實驗均經南通大學實驗動物倫理管理委員會審查(倫理審批號:20180822-002)。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠基因型快速鑒定試劑盒(PD101-01)、TRIzol 總RNA 抽提試劑(R401-01)、反轉錄酶試劑盒(R021-01)、2×Taq master mix(P111),SYBR Green 熒光PCR 試劑盒(Q711-02)購自南京諾唯贊生物科技公司；Veriti 96-well PCR 擴增儀購自美國Applied Biosystems 公司；MICROCL 21R 臺式冷凍離心機購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；EPS-300 數顯穩壓溫流電泳儀、HE-120 多功能水平電泳槽購自中國上海天能科技；Native-PAGE 垂直電泳系統購自美國Apogee 公司；BIO-RAD Gel Doc XR +凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad 公司；G:box Chemi XL 1.4 成像系統購自英國Syngene 公司；Light cycler 96 熒光定量PCR 儀購自瑞士ROCHE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠繁殖與取材

雄性雜合子Smn 敲除小鼠和雌性SMA Ⅲ型小鼠交配,取同窩出生4 d 齡的后代,通過基因型鑒定,區分SMA Ⅰ型及對照小鼠,并分別取4 只SMAⅠ型小鼠(Smn-/-SMN22tg/0) 和4 只對照小鼠(Smn+/-SMN22tg/0)心臟、肝、脾、肺、腎、腦、脊髓、肌肉組織。

1.3.2 RT-PCR

按照TRIzol 試劑盒及反轉錄試劑盒提取總RNA 并合成cDNA,采用Cy5 標記的引物進行RTPCR,94°C 30 s,55°C 30 s,72°C 25 s,28 個循環,取8 μL 擴增樣品,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增結果,剩余樣品用于非變性PAGE 定量分析,引物信息為:E6-F:5’-ATAATTCCCCCACCACCTCCC-3’,E8-467R:5’-TTGCCACATACGCCTCACATAC-3’。

1.3.3 非變性PAGE 及SMN2 外顯子7 列入

6%非變性PAGE 膠110 V 電壓下進行電泳,3 h后結束電泳。 G:BOX 系統顯影,用Image J 分析條帶灰度值, 并計算SMN2 基因外顯子7 列入(Inc%),公式如下:

1.3.4 實時熒光定量PCR

反應體系:SYBR Green Master Mix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA 1 μL,補滅菌雙蒸水7 μL 至20 μL 體系,每個樣品設置3 個重復。 反應條件:95℃預變性4 min,94℃下變性15 s,60℃下退火20 s,72℃延伸20 s 并讀取熒光值,45 次循環,循環后設置55℃～90℃,每隔0.3℃讀熒光值生成熔解曲線。 所有設定保存后運行程序。 反應完成后,選擇PCR base line subtracted 模式進行數據分析和修正。 在調整baseline cycles 和計算threshold value(閾值)后,得出cycle threshold(Ct 值),ΔΔCt法計算出樣本的相對表達量(RQ 值)。 在gene bank中查找并下載相關基因的mRNA 序列及相關信息,實時熒光定量PCR 引物采用Primer premier 5.0 軟件,嚴格按照相關原則設計。 引物信息見表1。

1.4 統計學方法

本實驗數據采用STATA 7.0 和GraphPad Prism 5.0 進行數據處理和統計學分析。 計量數據用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用t 檢驗,P＜0.05 表示兩組間差異顯著,P＜0.01 表示兩組間差異極顯著。

2 結果

2.1 SMN2 外顯子7 列入在腦和脊髓中與肝、腎和肌肉相比顯著增加

通過RT-PCR 和非變性PAGE 凝膠電泳分析,在出生后第4 天(P4)的SMA Ⅰ型小鼠大腦和脊髓中,SMN2 表達全長的有功能RNA 比例顯著高于其它三個非神經組織(圖1)。 表明SMA Ⅰ型小鼠中,SMN2 mRNA 在神經與非神經組織中的剪接差異機制與其體內可能差異表達剪接因子密切相關。

2.2 HNRNP 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平

核內不均一核糖核蛋白(HNRNPs)是主要存在于細胞核中的由多個蛋白組成的復合體,其主要功能是結合RNA 參與轉錄后修飾,在新合成的RNA(pre-mRNA)過程中不可缺少,是成熟mRNA 形成的重要剪接因子[8]。 如圖1 所示,本實驗檢測了出生后第4 天SMA Ⅰ型和對照小鼠的神經與非神經組織中HNRNP 家族中的Hnrnpk、Hnrnpl、Hnrnpll、Hnrnpu、 Hnrnpd、 Hnrnph3、 Hnrnpm、 Hnrnpf 以 及Hnrnph2 基因的mRNA 水平。 以心臟作為對照,這些剪接因子在心臟、肝及肌肉組織中表達相對較低,在脾、肺和腎中表達最高,在神經組織即大腦和脊髓中表達相對較高。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.3 SR 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平

富含絲氨酸和精氨酸剪接因子(serine/argininerich splicing factor,SRSF),常被簡稱為SR 蛋白,是一種涉及RNA 剪接的保守蛋白家族[9]。 如圖3 所示,本實驗檢測了SR 家族中的Srsf10、Srsf1、Srpk1、Srsf3、Srsf6、Srsf2、Srsf4、Srsf5、Srsf7 以及Srsf9 基因在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平。 以心臟作為對照,這些剪接因子基因在心臟、肝及肌肉中表達相對較低,在脾、肺和腎中表達最高,在神經組織即大腦和脊髓中表達相對較高。

2.4 NOVA 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平

神經腫瘤腹側抗原(neuro-oncological ventral antigen,NOVA)家族,有NOVA1 和NOVA2 兩個成員,其作為神經元特異性剪接因子,在運動神經元中表達豐富[10]。 本實驗檢測了NOVA 家族中的Nova1 和Nova2 基因在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平。 以心臟作為對照,這些剪接因子基因在心臟、肝、脾、腎及肌肉中表達相對較低,在大腦和脊髓中表達最高,在肺中表達相對較高(見圖4)。

2.5 HNRNP 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中的mRNA 水平差異化比較

通過比較HNRNP 剪接因子在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠中的mRNA 差異水平,如圖5可知,與對照小鼠相比,HNRNP 家族不同基因分別在SMA Ⅰ型小鼠不同組織中均有顯著性差異。 其中,與對照小鼠相比,Hnrnph2 在SMA Ⅰ型小鼠脊髓中顯著下調。

2.6 SR 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中mRNA 水平差異化比較

通過比較SR 剪接因子基因在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠中的mRNA 差異水平,如圖6可知,SMA Ⅰ型小鼠中,SR 家族不同基因分別在不同組織中與對照小鼠比較,均有顯著性差異,其中,與對照小鼠相比,Srsf7 和Srsf9 在SMA Ⅰ型小鼠脊髓中顯著上調,Srsf4 和Srsf10 在大腦中顯著下調。

2.7 NOVA 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠神經與非神經組織中mRNA 水平差異化比較

通過比較NOVA 剪接因子基因在出生后第4天的SMA Ⅰ型和對照小鼠中的mRNA 差異水平,如圖7 可知,Nova1 和Nova2 基因分別在SMA 小鼠的不同組織中和對照小鼠比較,有顯著性差異。 其中,與對照小鼠相比,在SMA Ⅰ型小鼠中,Nova2 在脊髓中顯著上調。

3 討論

脊髓性肌萎縮癥是由于SMN1 基因功能喪失而引起的一種神經退行性疾病,表現為脊髓α 運動神經元壞死,導致進行性肌肉萎縮、癱瘓甚至死亡[11]。而與SMN1 序列主要有10 個堿基差異的高度同源的SMN2 基因,由于其可被調控的特殊選擇性剪接即外顯子7 跳躍模式,并能翻譯出全長的SMN 蛋白,使得其成為治療SMA 疾病的“靶基因”[12]。 盡管已經研發出有效治療SMA 的藥物并獲批上市[13],但在病變累及多系統[14]的SMA 中,其僅針對特定組織且不能起到徹底治愈的效果,同時關于SMN2 外顯子7 列入是否具有組織間差異及其是否是導致SMA 多系統病變的原因等相關問題是未知的。

圖1 SMN2 外顯子7 在第4 天SMA Ⅰ型小鼠大腦和脊髓的列入比顯著高于肝、腎和肌肉組織Note. A, Non-denaturing PAGE electrophoresis showing the inclusion ratio of SMN2 exon 7 in central and peripheral tissues. B,Bar chart showing the inclusion ratio of SMN2 exon 7 based on gray level statistics. Compared with the liver,*P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 1 The inclusion ratio of SMN2 exon 7 in brain and spinal cord tissues was significantly higher than that in liver, kidney, and muscle tissue from SMA type I mice at postnatal day 4

圖2 HNRNP 剪接因子基因家族在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平Note. A, B, and C, QPCR analysis results of Hnrnpk, Hnrnpl, Hnrnpll, Hnrnpu, Hnrnpd, Hnrnph3, Hnrnpm, Hnrnpf, and Hnrnph2 gene expression in different tissues from SMA type I control mice at postnatal day 4. D, E, and F, QPCR analysis results of Hnrnpk, Hnrnpl, Hnrnpll,Hnrnpu, Hnrnpd, Hnrnph3, Hnrnpm, Hnrnpf, and Hnrnph2 gene expression in different tissues from SMA type I mice at postnatal day 4. Compared with the heart,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 2 mRNA expression levels of HNRNPs in the heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, brain,and spinal cord of type I and control SMA mice at postnatal day 4

圖3 SR 剪接因子基因家族在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平Note. A, B, C, and D, QPCR analysis results of Srsf10, Srsf1, Srpk1, Srsf3, Srsf6, Srsf2, Srsf4, Srsf5, Srsf7, and Srsf9 gene expression in different tissues from SMA type I control mice at postnatal day 4. E, F, G, and H, QPCR analysis results of Srsf10, Srsf1, Srpk1, Srsf3, Srsf6,Srsf2, Srsf4, Srsf5, Srsf7, and Srsf9 gene expression in different tissues from SMA type I mice at postnatal day 4. Compared with the heart,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 3 mRNA expression levels of SRs in the heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, brain,and spinal cord from type I and control SMA mice at postnatal day 4

圖4 NOVA 剪接因子基因家族在出生后第4 天的SMAⅠ型和對照小鼠的心臟、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平Note. A, QPCR analysis results of Nova1 and Nova2 gene expression in different tissues from SMA type I control mice at postnatal day 4. B, QPCR analysis results of Nova1 and Nova2 gene expression in different tissues from SMA type I mice at postnatal day 4. Compared with the heart,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 4 mRNA expression levels of NOVAs in the heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, brain,and spinal cord from type I and control SMA mice at postnatal day 4

圖5 HNRNP 剪接因子基因家族在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平差異化比較Note. A, QPCR analysis results of the differences in Hnrnpk, Hnrnpl, Hnrnpll, Hnrnpu, and Hnrnpd gene expression in different tissues. B, QPCR analysis results of the difference between Hnrnph3, Hnrnpm, Hnrnpf, and Hnrnph2 gene expression in different tissues. Compared with the corresponding organization in control mice,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 5 Comparison of differences in HNRNP mRNA levels in the heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle,brain, and spinal cord from type I and control SMA mice at postnatal day 4

圖6 SR 剪接因子基因家族在出生后第4 天的SMA Ⅰ型和對照小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平差異化比較Note. A, QPCR analysis results of the differences in Srsf10, Srsf1, Srpk1, Srsf3, and Srsf6 gene expression in different tissues. B, QPCR analysis results of the differences in Srsf2,Srsf4, Srsf5,Srsf7,and Srsf9 gene expression in different tissues. Compared with the corresponding organization in control mice,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 6 Comparison of differences in SRs mRNA levels in the heart, liver, spleen, lung, kidney,muscle, brain, and spinal cord from type I and control SMA mice at postnatal day 4

本研究發現,在SMA Ⅰ型小鼠中,SMN2 外顯子7 的列入具有組織間差異,且在神經組織中的列入顯著高于非神經組織。 而外顯子是否列入是由剪接因子所調控的選擇性剪接來決定的,因此,有必要篩選在神經組織與非神經組織存在的差異表達剪接因子,尋找促進SMN2 外顯子7 在神經組織中列入的剪接因子,為SMA 疾病提供新的治療方法。 而本實驗重點檢測了SMA Ⅰ型小鼠8 個組織中HNRNP、SR 及NOVA 三類經典剪接因子的mRNA 水平,發現這21 個剪接因子的mRNA 水平均具有組織間差異,其中HNRNP 家族9 個成員及SR家族10 個成員均在非神經組織中表達最高,而NOVA 家族2 個成員均在神經組織大腦及脊髓中表達最高,與SMN2 外顯子7 在神經組織中高列入呈正相關。

而在SMA Ⅰ型對照小鼠中,我們發現剪接因子表達與SMA Ⅰ型小鼠中檢測到的表達變化相似,表明無論是在SMA Ⅰ型還是對照小鼠中,這些剪接因子基因水平表達均具有組織間差異,尤其是NOVA家族成員均在神經組織中高表達,再次證明了NOVA 是神經特異性表達的剪接因子[15]。 進一步對剪接因子的表達差異進行研究,發現與對照小鼠相比,SMA Ⅰ型小鼠脊髓組織中,Srsf7、Srsf9 及Nova2 顯著上調,與SMN2 外顯子7 在脊髓中高列入呈正相關,SRSF7、SRSF9 及NOVA2 極有可能參與SMN2 的剪接調控。 而在其它特定組織中,某些剪接因子顯著變化,如心臟組織中HNRNPH3、SRSF3 顯著下調,可能是引起SMA 疾病多系統病變的原因之一。

圖7 NOVA 剪接因子基因家族在SMA Ⅰ型和對照小鼠出生后第4 天心、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦和脊髓中的mRNA 水平差異化比較Note. QPCR analysis results of the differences in Nova1 and Nova2 gene expression in different tissues. Compared with the corresponding organization in control mice,*P ＜0.05,**P ＜0.01.The mRNA level of the control group was 1.Figure 7 Comparison of differences in NOVAs mRNA levels in the heart, liver, spleen, lung, kidney,muscle, brain, and spinal cord from type I and control SMA mice at postnatal day 4

導致SMA 疾病的最直接原因是運動神經元存活蛋白(SMN)合成減少,功能喪失。 而SMN 是一種以其在SMN-Gemin 多蛋白復合物中的管家作用而聞名的蛋白,其參與了小核蛋白(SnRNP) 的組裝[16],調控前體mRNA 剪接,同時還參與機體多種生理功能,包括應激反應、軸突運輸、細胞骨架動力學、線粒體和生物能量途徑以及泛素途徑等[17]。Groen EJN 等[18]在嚴重型SMA 小鼠模型中發現SMN 蛋白的表達具有組織間差異,且在神經組織中表達最高,與本實驗中SMN2 外顯子7 列入的組織間差異相一致,SMN 可能是調控SMN2 外顯子7 組織特異性列入的因子之一。 與此同時,HNRNP 家族成員HNRNPR,已被證明能夠與SMN 蛋白在運動神經元中直接相互作用[19]。 同時,由RNA 識別基序(RRM)區和由絲氨酸和精氨酸的重復序列組成的RS 區兩個結構域組成[8]的SR 蛋白,已發現其在不同組織中差異表達[20],且能夠調控SMN 蛋白的表達[21]。 而本實驗在研究時,發現Hnrnph2 顯著下調,Srsf7、Srsf9 及Nova2 表達顯著上調,這可能是因為受到SMN 蛋白的調控,從而表達發生上調或下調。

除此之外,神經特異性表達的剪接因子NOVA1或NOVA2 與多種神經系統疾病有密切關系[22],本研究發現SMA 小鼠中Nova1 及Nova2 表達與SMA相關基因SMN2 外顯子7 列入呈正相關,表明NOVA 家族與SMA 疾病之間存在著某種聯系。 同時,NOVA 與HNRNPK、MER1 等蛋白均具有KH 結構域[23],且具有調控剪接的作用,而其調控剪接的作用是與靶mRNA YCAY[24-25]元件結合來實現的,通過序列分析,發現在SMN2 外顯子7 內有該序列,提示NOVA1 或NOVA2 可能結合該序列直接調控SMA 相關基因SMN2 剪接。 而有關SRSF7/9 和NOVA 剪接因子對SMN2 外顯子7 列入的具體調控機制有待深入研究。

綜上所述, SMA Ⅰ型小鼠中,SMN2 外顯子7列入及相關剪接因子的表達變化具有組織間差異,且神經組織中,Srsf7/9 和Nova1/2 高表達與SMN2外顯子7 列入顯著提高呈正相關,剪接因子SRSF7/9 及NOVA1/2 可能參與SMN2 基因的剪接調控。