基于MassArray法對PCOS患者DENND1A基因啟動子甲基化關聯性的研究

鄭 水*，楊文娟，袁彥玲，謝正媛，李寶鑫

（1.云南省人口和計劃生育科學技術研究所，云南 昆明 650021；2. 昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650032）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征。在育齡婦女中的發生率約為6%～8%[1]，其發病與表觀遺傳學異常相關。既往有關PCOS表觀遺傳學的研究集中在DNA甲基化這一現象上。既往研究驗證了DENND1A與PCOS發病具有關聯性[2]。通過檢測DENND1A啟動子甲基化的水平，可初步了解DENND1A與PCOS發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

病例組為育齡PCOS患者14例，對照組8例。采集患者不含卵子的卵泡液，保存至-20℃備用。

1.2 方法

1.2.1 目標基因序列的生物信息學分析

利用EMBOSS Cpgplot工具測序列潛在的CpG島并，設計引物設計。

1.2.2 MassArray甲基化檢測

卵泡液1000rpm離心后取上清，酚氯仿法提取DNA。DNA樣本經過NaHSO3處理后進行PCR擴增；PCR擴增反應體系為ddH2O 4.9μL，含dNTPs的10×PCR Buffer 1.0μL，dNTPs（25mM）0.8μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.6μL，上下游引物（10pmo/μL）各0.2μL，DNA模板2.0μL。2個GpC島位于引物為5’-aggaagagagGGTGTAGATGTGTAA GGGTTTGTAA-3’， 5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggc tACTTAATCCTAAAACCCATAATCCC-3’，和5’-aggaa gagagGGGATTATGGGTTTTAGGATTAAGT -3’，5’-ca gtaatacgactcactatagggagaaggctAAAAAACCATTTTCAAAA ACTCTCC -3’。PCR擴增程序為94℃ 4min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 1min共45個循環；72℃ 5min。PCR擴增產物進行SAP反應，之后進行Mass Cleavage反應。采用Agena MassARRAY Analyzer質譜儀進行檢測。

2 結 果

2.1 MassArray甲基化檢測結果

2個CpG島分別檢測到27和15個CpG位點，甲基化水平≥10%的CpG位點共有9個（表1）。

表1 甲基化水平≥10%的CpG位點

2.2 兩組一般資料和激素水平比較

PCOS 組AMH水平顯著高于對照組(P＜0.01)。其余變量兩組間差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 兩組患者一般臨床資料和基礎激素水平

3 討 論

甲基化檢測結果表明，DENND1A基因啟動子的某些位點確有較高的甲基化水平。對P值的計算結果顯示，在所檢測的CpG位點中PCOS組和對照組之間無顯著性差異。明確PCOS的致病原因有助于疾病本身的早期診斷和治療，也有助于解釋疾病以及并發癥的關系。敲除DENND1A.V2蛋白編碼基因則同時抑制了CYP17A1 和CYP11A1 基因轉錄及雄激素合成[3]，因此推斷DENND1A 基因對PCOS 患者的高雄表型有著重要影響，但目前尚無PCOS患者DENND1A基因啟動子甲基化方面的研究。PCOS發生機制的研究需考慮環境因素引起的表觀遺傳改變。

甲基化研究方法眾多，較為常見的有甲基化特異性PCR、亞硫酸氫鹽測序法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析和焦磷酸測序等。MassARRAY飛行質譜檢測系統可實現甲基化定量檢測。本研究采用MassArray法對PCOS患者DENND1A基因啟動子甲基化進行研究，旨在獲得PCOS患者與非PCOS患者在DENND1A基因啟動子甲基化的差異。