核型多角體病毒生活周期及宿主抗病毒反應的研究進展

況文東，占智高，王金昌，關麗梅，李江懷，靳 亮

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

核型多角體病毒屬于桿狀病毒科 (Baculoviridae)，絕大多數核型多角體病毒屬于 alpha桿狀病毒屬 (Baculovirus)，該病毒屬可分為2組(group I、group II)(圖 1)[1]，是無脊椎動物的致病性病毒，廣泛分布于環境中[2]。核型多角體病毒是一類有囊膜的病毒，基因組為雙鏈環狀 DNA 病毒，大小為80～180 kb，大多數NPV的包涵體(occlusion body, OB)大約0.6～3 μm[2]。核型多角體病毒的主要宿主為鱗翅目昆蟲幼蟲，隨著日齡增大而抵抗力增強。此外，少數NPV也感染雙翅目和膜翅目昆蟲幼蟲。

圖1 桿狀病毒進化樹分析，基于37個桿狀病毒核心基因的氨基酸序列

在核型多角體病毒感染周期中，產生2種不同表型的子代病毒，芽生型病毒(budded virion，BV)和包涵體來源的病毒(occlusion-derived virion，ODV)(圖2)。BV和ODV基因組相同，但是核衣殼以及囊膜有所不同。BV可導致昆蟲組織間(氣管上皮、血細胞、中腸上皮、脂肪體等)病毒的傳播，昆蟲間的傳播主要通過未感染昆蟲食用被ODV污染的食物所致[3]。BV病毒在細胞培養中早在12～18 hpi就大量產生[4]。在感染后期，許多核衣殼被保留在核內，隨后被核膜衍生膜包裹[5]。這些新包被的ODV病毒在細胞核被包裹在多角體蛋白中，并結晶形成包涵體(Occlusion Bodies，OB)。每個苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ODV病毒通常含有多個(約5～25)核衣殼[6]。因此，一個 AcMNPV OB 可能攜帶數百個核衣殼。在昆蟲感染后期，細胞溶解后，昆蟲尸體發生液化，被感染的細胞釋放出OBs。昆蟲尸體液化是一個至少由2種病毒編碼的酶(幾丁質酶和組織蛋白酶)介導的過程，該酶催化昆蟲外骨骼的分解和OBs釋放到環境中[7-8]，被昆蟲食用后，開始一個新的感染循環。在利用昆蟲細胞培養時，BV和ODV都可以產生，但由于ODV病毒在細胞系中的感染能力有限，所以細胞間的感染是由BV病毒引起的[9]。目前還沒有合適的模擬體內中腸細胞感染的培養系統，因此ODV的感染實驗通常是在昆蟲體內進行的[10]。

圖2 NPV包涵體(OB)、包涵體病毒(ODV)和芽生型(BV)結構示意圖

ODV嵌入蛋白質晶體基質中形成OB；ODV和BV包膜及其核衣殼含有許多蛋白質。主要核衣殼蛋白VP39構成核衣殼，存在于整個核衣殼中。VP78/83位于核衣殼的一端。融合蛋白GP64(NPV I組)或F蛋白(NPV II組)在整個BV包膜中都有發現，但在一端(可能是錐形端)可發生聚集[11]。

NPV在農業和林業生產中，主要用作生物殺蟲劑，在國內作為生物農藥登記的數量有64種，分別是：甜菜夜蛾核型多角體病毒(10種)、斜紋夜蛾核型多角體病毒(12種)、棉鈴蟲核型多角體病毒(29種)、甘藍夜蛾核型多角體病毒(6種)、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(7種)；在基因工程研究中，NPV還可以作為蛋白表達載體(Bacmid 系統)，可以有效地表達干擾素、抗原等外源蛋白[12]。此外，NPV還有一個非常重要的特性：它可以將外源基因轉導到哺乳動物細胞中，但本身并不復制[13-16]。這使得NPV在基因治療及哺乳動物細胞表達系統的構建中具有重要的應用前景。但在實際應用過程中，還存在許多的問題，比如：絕大多數NPV病毒的宿主譜比較窄，拓寬NPV的宿主譜可以使NPV成為更加有效的生物殺蟲劑；此外，NPV感染哺乳動物細胞的轉導效率有待進一步的提高。這些問題的解決都有賴于對NPV生物學特性的詳細了解，比如：細胞(吸附和)入侵等生活周期的詳細機制。本文對NPV生活周期(入胞、入核、復制、表達、組裝和出芽)的不同階段逐一進行討論，并介紹宿主抗病毒反應的最新研究進展；最后，提出一些在未來的研究過程中需要解決的一些問題。

1 核型多角體病毒的生活周期

1.1 侵入細胞過程

1.1.1 ODV入侵 ODV病毒特異性結合昆蟲中腸上皮細胞，多角體蛋白是ODV在環境中(紫外，干燥)保持穩定的主要原因。OB的表面覆蓋一層由碳水化合物和蛋白質組成的外層，OB在昆蟲中腸堿性環境中發生降解釋放ODV，OB中含有一種金屬蛋白酶VEF，它可以破壞昆蟲腸道周圍營養基質形成的生理屏障并提高感染效率[17-18]。ODV病毒通過直接與微絨毛膜融合進入中腸上皮細胞[19-20]。ODV包膜含有至少13種完整的膜蛋白。其中9個膜蛋白與病毒入胞有關，這些蛋白統稱為經口感染因子(perosinfectivity factor, PIF)。目前認為，病毒的PIF參與ODV與中腸微絨毛膜結合和融合。第一個發現對口腔感染和可能的受體相互作用重要的ODV包膜蛋白是 p74 (ac138)，PIF 的缺失會導致病毒無法經口感染，但是不影響ODV病毒的裝配或將ODV病毒組裝成OB，且不影響BV的產生或傳染性，多種PIF蛋白可以形成穩定的復合物，并具有蛋白酶抗性，使其在富含蛋白酶的腸道環境中發揮作用[21-25]。但是關于PIF蛋白介導病毒侵入宿主細胞的具體機制還有待進一步的研究。

1.1.2 BV入侵 BV和ODV囊膜脂質體成分差異非常大，這提示這2種類型病毒獲得囊膜和入胞途徑有所不同。ODV侵入中腸上皮細胞以后，出芽產生BV病毒，進入昆蟲的血淋巴循環，感染其它細胞。不同的NPV BV可以通過網格蛋白介導的內吞作用(clathrin-mediated endocytosis (CME))、膜融合(direct membrane fusion (DMF))、胞飲作用中的一種或者多種方法入胞[26]。AcMNPV主要通過網格蛋白介導的內吞作用感染昆蟲，在這個過程中肌動蛋白介導病毒內化，微管負責包裹病毒早期內體的移動[12]。在感染過程中還有少部分(約10%)AcMNPV的囊膜可以直接和細胞質膜融合，而后侵入細胞[27]。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)BV病毒進入細胞質后，在內體的病毒可能通過內體分選復合物(the endosomal sorting complex required for Transport，ESCRT)[28]和N-乙基馬來酰亞胺敏感因子蛋白(N-ethylmaleimide sensitive factor protein，NSF)[29]，進一步深入細胞質中，隨后包含病毒的內體發生酸化，內吞的病毒囊膜和細胞膜發生融合，釋放核衣殼至細胞質中[30]。細胞OB的包膜與ODV的包膜有所不同，BV特異性包膜糖蛋白是GP64或F蛋白。GP64是病毒進入細胞的必要條件[31]，另外2種BV包膜蛋白(ODV-e25(Ac94)和ODV-e18(Ac143))對BV的感染性也非常重要[32]。GP64是一種III類病毒膜融合蛋白，在NPV中高度保守，只存在于alpha桿狀病毒group I中(AcMNPV、CfMNPV和OpMNPV)。GP64通過二硫鍵形成三聚體，與宿主細的胞磷脂雙分子層細胞膜相互作用，介導病毒入胞。其他的BV包膜蛋白(F樣蛋白、v-ubi、gp37和BV/ODV-e26)可能影響BV的產生水平，但對于BV的感染性不是必須的。F蛋白主要發現于alpha桿狀病毒group II NPV (SEMNPV、HzSNPV和 LdMNPV)，它的功能與GP64類似，但在結構上有顯著差異。在group I中也發現F蛋白編碼基因，但通常認為它不再作為這些病毒的融合蛋白發揮作用。在AcMNPV中敲除AcMNPV F-like蛋白基因 (ac23)對BV的產生或BV的感染性存在爭議[33-34]，但會影響ODV的包涵體形成和致病性[35]。在group II NPV中，F基因敲除會導致病毒感染性的喪失。BV入胞需要GP64和F蛋白，但是它們結合的受體還是未知的。有一部分研究證明BV的入胞過程不需要蛋白質受體，因為研究發現 NPV 可以結合不含蛋白質的脂質體[2]。

1.2 入核過程

NPV 核衣殼在肌動蛋白的幫助下到達核孔，與核孔復合物發生相互作用，并通過核孔。BmNPV核衣殼從內體釋放后，核衣殼結構蛋白P78/83 (Ac9)在BV/ODV-c42 (orf101; c42)的介導下入核，募集細胞Arp2/3，促進肌動蛋白聚合，隨后肌動蛋白細胞骨架發生變化，推動核衣殼[36-37]。Fang的工作提示病毒蛋白Ac132的NEBU結構域可穩定F-肌動蛋白，這可能附著在核衣殼上，然后將核衣殼推入細胞核[3]。此外，研究表明宿主蛋白importin-β也參與了該過程。ODV中多個核衣殼釋放到細胞質中以后，在肌動蛋白引導下，將核衣殼運輸到細胞核附近[38]。ODV和BV核殼體與核孔復合物 (NPC) 的相互作用及穿過核孔的過程類似[11, 39]。ODV進入細胞的多個核衣殼，一部分還可以快速中腸上皮細胞的基底膜，與GP64組裝形成BV，進入血腔，感染其它細胞。這一過程顯著縮短了BV的產生時間，提高了病毒感染效率[40]。NPV是研究大分子入核的理想模型，對該過程的解析將有助于了解NPC的轉運機制，同時對于NPV的防治及作為殺蟲劑的利用都將奠定重要的理論基礎[41]。

1.3 病毒基因組復制、轉錄和翻譯過程

病毒DNA入細胞核后，病毒復制開始于細胞核中心附近形成病毒性基質。這是病毒DNA的轉錄、復制以及核衣殼裝配的位點。NPV基因表達主要受轉錄水平的調控，轉錄過程可以分為：早期、晚期和極晚期轉錄。每個階段基因復制和表達依賴于前一階段基因的表達，早期基因擁有能被宿主RNA聚合酶II識別的啟動子功能序列，其表達產物(RNA聚合酶)參與或調控病毒基因的復制和晚期基因的表達[42]。早期基因的表達對于病毒DNA復制和晚期基因的表達是必須的，而晚期基因主要表達病毒結構蛋白[43]。DNA復制后期(感染后6-18 h)，核衣殼開始組裝。NPV單鏈DNA結合蛋白LEF-3含有一個介導其核輸入的NLS，在該過程中，LEF-3可以促進蛋白p143入核，使p143發揮解螺旋作用促進DNA復制。AcMNPV DNA聚合酶在病毒DNA復制過程中發揮非常關鍵的作用，其N端(氨基酸位點1-186)motif在桿狀病毒科中非常保守，對于DNA聚合酶發揮功能是必須的[44]。包膜蛋白BV/ODV-e26的缺失可以導致DNA復制水平的降低[45]。

NPV的DNA結合蛋白DBP對于病毒基因轉錄也非常重要[46]。研究發現orf61缺失使病毒早期基因lef-3、晚期基因vp39及極晚期基因p10的轉錄水平顯著下降[47]。Fang等發現，AcMNPVac124缺失會導致病毒幾丁質酶轉錄水平的顯著降低[48]。在體外翻譯系統證明，極晚期基因p10 5′UTR對于翻譯起始非常關鍵。利用帽類似物不抑制p10 5′UTR驅動的翻譯，表明極晚期的NPV mRNA以不依賴帽的方式翻譯[49]。此外，Ranjan等對AcMNPV mRNA起始翻譯的序列進行分析，發現該病毒mRNA翻譯起始位點附近的序列為 aag/ta/tat/aa/cAAaATGaa/ct/ag/aAan，同經典的Kozak (GCC)GCCA/GCCATGG差異非常大[50]。

1.4 病毒組裝和出芽過程

1.4.1 ODV組裝和出芽過程 NPV 基因組入核后，在核中進行DNA復制和表達，核衣殼在細胞核的病毒發生基質中進行組裝，然后轉運到核周邊的電子發光區，轉運過程需要核肌動蛋白和核衣殼蛋白 AC102、VP80 (Ac104)、P78/83 (Ac9)、VP1054 (Ac54)和BV/ODV-C42 (Ac101)的參與[51-53]。在該區核衣殼組裝成BV或者ODV，具體的機制未知。據估計，97%的基因組DNA組裝成ODV或者保留在細胞核，另一部分DNA則出芽后形成BV。AcMNPVac83基因上的順式作用原件對核衣殼組裝至關重要[25]。ODV在病毒蛋白Ac76、Ac75和Ac93等的介導下披上內核膜或者外核膜[5, 54]，而后運送到核中指定位置，在多角體蛋白的包裝下，形成包涵體。病毒蛋白質Ac76、Ac75和Ac93也是核衣殼從核中穿梭至細胞質中最終形成BV所必需的。ODV中核衣殼的數量受到病毒基因型及宿主細胞類型的影響。ODV與多角體蛋白結合后，隨后在病毒周圍結晶[2]。NPV的OB大小及ODV數量是受病毒種類影響的。成熟的OB外層由碳水化合物和Ac131組成，最外層的形成，有賴于功能性p10蛋白和細胞核纖維結構。如果Ac131或者p10缺失，將導致OB失去最外層結構，OB會變得不規則，且易碎[55-56]。從AcMNPV基因組中敲除GP41 (ac80)，病毒不再形成BV并且不再組裝ODV，這表明該基因在桿狀病毒病毒體形態發生中也發揮重要作用[57]。關于包涵體的形成過程，還有很多未解之謎：1)ODV的數量受什么調控；2)多角體蛋白結晶的觸發機制；3)結晶過程的調控機制。這些問題的解決使我們對NPV的生活周期有更加深刻的了解，同時豐富的病毒學領域關于病毒生活周期的理解，也為NPV的防治及利用提供大量理論基礎。

1.4.2 BV組裝和出芽過程 在核中組裝的核衣殼，大部分組裝成ODV，少部分出核形成BV。盡管核衣殼選擇性形成ODV或BV的具體機制不詳，但是推測可能與ODV和BV核衣殼上特異性的蛋白質有關。研究表明NPV核心基因38K(Aac98)編碼的鹵酸脫鹵素酶同源物通過介導P6.9 (Ac100) 的C末端的5個特定位點的去磷酸化參與核衣殼裝配[58]。研究表明，BV核衣殼的泛素化水平高于ODV的核衣殼，推測，泛素化是一個出核信號。泛素化位點可能主要存在于Ac66蛋白中。缺失Ac66和病毒的E3泛素連接酶Ac141，病毒無法出核。orf61基因敲除后將會導致病毒核衣殼不能從細胞核轉運到細胞質中，導致病毒粒子(BV)不能裝配[47]。Li等報道Hsp90可以通過促進核肌動蛋白聚合來幫助BV從細胞核穿梭到細胞質中[59]。AcMNPV BV 核衣殼蛋白Ac51缺失不會中斷核衣殼組裝和包涵體來源的病毒 (ODV) 形成，但是會阻礙核衣殼的出核，導致轉染細胞上清液中的BV產生顯著降低[60]。透射電鏡的觀察結果顯示，BV離開細胞核主要是通過出芽方式。BV出芽獲得雙層核膜后，進入細胞質以后，BV核衣殼脫去核膜，在肌動蛋白的推動下，向質膜方向移動。通過ESCRT途徑[28]，BV到達出芽位點，病毒囊膜蛋白GP64和ME53 (Ac140)等蛋白的作用下發生出芽，出芽后，游離的BV可以進行下一輪細胞感染。

2 宿主抗病毒反應

昆蟲對NPV的免疫反應可分為2個階段：一是消化道對ODV的防御；二是脂肪體、氣管和血細胞等其他組織對BV的防御。在感染初期，家蠶中腸內合成抗病毒蛋白脂肪酶 Bmlipase-1，并分泌到腸道液中，抑制BMNPV復制，具體機制尚不清楚[61]。在昆蟲，RNAi 通路通常被認為是一種抗病毒天然免疫。在轉基因RNAi家蠶中表達病毒基因dsRNA可以抑制BmNPV的復制[62]。Ponnuvel等報道AcMNPV可以通過降低Sf9細胞內豐富的miRNAs 促進自身的復制，并推測該過程是通過下調宿主蛋白Ran介導的[63]。此外，過表達家蠶 miRNA bmo-miR-2819可以下調BmNPV IE-1水平從而抑制病毒感染，病毒感染后可以通過未知機制下調以bmo-miR-2819，從而拮抗宿主的抗病毒反應[64]。家蠶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶通過增加ATGs表達來抑制BmNPV的增殖，BmNPV拮抗這條抗病毒的機制尚不明確[65]。BmNPV感染后可以導致cGAMP水平的上升，促進干擾素基因刺激因子(STING)介導的 NF-κB活性的增強，促進抗病毒基因的表達[66]。Liu等用脂多糖、肽聚糖、葡聚糖和NPV刺激家蠶，發現中腸和脂肪體中小休克蛋白sHSP21 mRNA水平明顯上升，提示該蛋白可能參與家蠶抗病毒天然免疫[67]。最近日本科研人員發現，在中國家蠶中發現腫瘤抑制基因p53 的同源基因Bm-p53，并且發現該基因可以通過促進家蠶的凋亡而參與抗NPV過程中[68]。家蠶ser/thr蛋白磷酸酶2A (PP2A)被報道具有抗BmNPV的活性[69]。受體酪氨酸激酶 (RTK) 拮抗蛋白Spry可以負調控ERK信號通路，Guo等發現家蠶中Spry也具有抗病毒活性，BmNPV 感染家蠶后，會導致BmSpry表達水平下降p-ERK水平上升，從而拮抗該蛋白的抗病毒活性[70]。此外，JAK/STAT信號通路對于果蠅的抗病毒反應也是非常重要的，BmNPV感染家蠶后可以引起該信號通路的激活，具體的抗病毒機制還有待進一步的研究[71-72]。

上述抗病毒研究為家蠶抗病毒藥物的研發提供潛在靶點。Li等用NPC1拮抗劑(丙咪嗪或U18666A)預處理家蠶胚胎細胞，可以顯著下調家蠶細胞NPC1的表達，可以有效阻止病毒進入細胞[73]。以PI3K-Akt為靶點的商業化合物，并選擇以下7種口服藥物進行進一步分析：afuresertib、AZD8835、AMG319、HS173、AS605240、GDC0941和BEZ235。這些候選藥物可以有效抑制BmNPV在BmE細胞中病毒基因的表達。其中，AMG319和AZD8835能有效抑制病毒在家蠶幼蟲中的復制，提示這2種藥物在家蠶的抗病毒反應中具有一定的應用潛力[74]。

3 結束語

近幾年隨著分子生物學技術的發展和高通量分析技術手段的不斷涌現，人們對于NPV與宿主的相互作用有了更深、更廣的認識，使得人們在NPV的病毒學研究、免疫學研究、細胞生物學研究等領域取得了豐碩的成果。為了更好地防治和利用NPV，圍繞該病毒的生活周期，仍需對以下幾個方面進行更加深入的研究：1)NPV 配體及細胞受體的鑒定；2)NPV DNA包裝成ODV或BV的分選機制；3)NPV在胞質中的病毒蛋白是如何返回細胞核組裝成病毒粒子的；4)建立模擬ODV感染中腸組織的體外培養系統；5)與普通病毒相比，NPV作為一個大的病毒粒子是如何逃避宿主的免疫系統的。在這些研究的基礎上，可以開發新的NPV治療藥物，豐富人們關于病毒宿主和組織嗜性、病毒組裝以及病毒與宿主免疫相互作用的認識。