體外產氣法評定耐重金屬飼料桑的飼料價值

黃江麗，何 力，計少石，張志紅，彭 建，丁建南，張華琦，圣 平*

(1.江西省科學院生物資源研究所，330096，南昌；2.樂平市三王牧業有限公司，333300，江西，景德鎮)

0 引言

我國多目標區域地球化學調查項目已發現我國局部地區土壤重金屬污染嚴重。江西有色金屬礦產豐富，重金屬污染的背景值本來就高，是我國重金屬污染最為集中的地方之一。為遏制新的污染，并對歷史上累積在土壤中的重金屬進行有效治理，科學家努力尋找各種緩解或修復重金屬污染的技術，目前利用超高富集重金屬植物緩解和修復重金屬污染土地成為研究熱點。據湖南省蠶桑科學研究所的研究，桑樹是鎘等重金屬高吸附植物，可作為重金屬污染農田耕作改制的重要選擇品種：鎘等重金屬主要沉積在桑樹的根和莖干，而枝葉的沉積量很低，其含量符合國家飼料衛生標準(GB13078-2017)。該分布特點表明，根莖中的重金屬可通過工業回收利用，不會形成二次污染，對于修復重金屬污染土地將發揮重要作用；而桑葉作為畜禽飼料也是安全的。因此，種桑治污、種桑喂畜，可謂一舉兩得，可產生巨大的經濟效益、社會效益和環境效益。

我國科研人員通過人工選擇與雜交育種，培育出的抗逆性品系——飼用桑目前已被廣泛用于豬、牛、羊、雞等動物的飼養。飼料桑是一種產量高，營養豐富，飼用價值大，極具開發潛力的功能性飼料資源。有研究表明，鮮桑葉干物質含量約25%，其干物質中的粗蛋白含量可達16%～30%，與大多數豆類牧草的蛋白質含量相近，且其氨基酸含量較高，種類豐富，可作為一種良好的蛋白質飼料。經引種試驗發現，飼料桑在湖南紅黃壤地區長勢良好，具有很好的推廣價值[1]。但利用在污染區種植飼料桑飼喂牛的報道較少，亦未見其對肉牛瘤胃的發酵特性的報道。李文娟[2]等采用體外產氣法評定了桑葉的飼用價值，為其作為反芻動物粗糧提供了依據，本研究采用體外瘤胃發酵法研究飼料桑粉與牛用全價精料的瘤胃發酵特性，為飼料桑粉代替牛用全價精料的研究開發提供理論依據，同時為緩解重金屬污染的同時，開發一種蛋白質飼料資源，為其在養牛生產中的應用提供理論依據，可為我國反芻動物的飼養節約成本，對解決“人畜爭糧”矛盾具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其成分測定

飼料桑粉的制備：于種植豐產期采集距離地面1 cm的桑葉(三倍體飼料桑)，將葉片于65℃烘干24 h，在室內空氣中回潮24 h，稱重粉碎，過40目篩，置于陰涼處儲存待分析。

干物質、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、重金屬含量等常規樣品成分分析在實驗室條件下進行測定，測定方法參照《飼料分析及飼料質量檢測》第3版的方法[3]。

1.2 試驗動物及其飼養管理

選取3頭健康，裝有永久性瘤胃瘺管的成年廣豐黃牛為試驗動物，體重350±20 kg，驅蟲，預飼期2周，試驗日糧精粗比6:4，試驗牛的日糧組成(見表1)，每天喂料2次(07:30和16:30)，自由飲水，單槽飼養。試驗期于晨飼前采集瘤胃液。

表1 試驗動物日糧組成

注：每千克預混料含維生素 A50 萬、維生素 D38萬和維生素E2000 IU、煙酸 80、Cu2、Fe10、Mn8、Zn6、Se0.02、I0.1和Co0.02 g。

1.3 試驗方法

體外法測定飼料桑粉與牛用全價精料的瘤胃液發酵特性。試驗設1個空白組(編號為CK)和2個試驗組，每組12個重復。對照組不添加底物，試驗1組以2 g飼料桑粉為底物，編號為ST；試驗2組以2 g牛用全價精料為底物，編號為JT。

表2 試驗設計方案

本試驗方法采用Mauricio[4]等的壓力讀取式體外產氣系統進行體外瘤胃發酵培養。厭氧人工瘤胃緩沖液的配制按Menke[5]等的方法配制。

在試驗當天晨飼前抽取3頭瘺管牛的瘤胃液放入保溫瓶內并迅速帶回實驗室，以防止微生物區系發生改變。正式試驗前將瘤胃液混合均勻后經4層紗布過濾，量取所需體積(瘤胃液與人工瘤胃營養液的體積比為1:2)的瘤胃液迅速加入到準備好的人工瘤胃液營養液中，制成混合人工瘤胃培養液。混合人工瘤胃培養液通入無氧CO2，同時邊加熱邊用磁力攪拌器攪拌，調節pH至6.9～7.0后，39℃水浴30 min。水浴完成后，用手動分液器向每個已準備好底物的培養瓶中分別加入50 mL上述培養液，通無氧CO2排盡培養瓶內氧氣后迅速蓋好蓋子并密封。混勻培養瓶中底物，置于39℃恒溫培養箱中開始培養，記錄起始時間。整個操作過程應保證在厭氧條件下進行。當培養至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各時間點時，取出培養瓶，用壓力讀取器快速讀取瓶內壓力并記錄。讀數后及時排氣至培養瓶壓力為0。

1.4 培養終止并取樣

在體外培養條件下培養12 h和24 h時，在這2個時間點每個處理包括空白組各拿出6個培養瓶快速放入冰水浴中停止發酵。中止發酵后將培養瓶拿出恢復到室溫后用pH計測定發酵液pH值。每個點取3瓶用來測干物質消失率，另3瓶取發酵液經低溫離心(4℃、8 000 g、15 min)，取上清液冷凍保存以備測其它發酵參數(BCP、VFA、NH3-N)的測定。

1.5 發酵參數測定

體外發酵產氣量測定參照Mauricio[4]等方法。當培養至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各時間點時，取出培養瓶，用壓力讀取器快速讀取瓶內壓力并記錄。讀數后及時排氣至培養瓶壓力為0。

產氣量計算公式：

式中：GPt為樣品在t時間段的產氣量(mL)；Pt為t時間段讀取的壓力(kPa)；V0為瓶子體積；101.3為標準大氣壓(kPa)；W為樣品干物質重。產氣過程的總積累產氣量為各時間段產氣量之和。

發酵液的pH值直接由pH計測定。

培養液用紗布過濾，濾渣無損失地轉移入100 mL大坩堝中，65℃烘干，測定干物質降解率。干物質消化率(DM，%)=(樣本DM重-殘渣DM重+空白管DM重)/樣本DM重×100。

菌體粗蛋白(BCP)含量測定參照Zinn[6]等分步離心法進行樣品的預處理，取經預處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液10 mL，以16 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀的細菌部分加以9 mL、10%三氯乙酸溶液，混勻，再以4 000 r/min離心10 min，取沉淀物加少量5%氫氧化鈉溶解后稀釋至25 mL。此稀釋液又經4 000 r/min離心10 min，取上清液在紫外分光光度計上用280 nm和260 nm波長進行比色。細菌蛋白含量計算公式如下：

細菌蛋白質含量(mg/mL)=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數。

氨態氮(NH3-N)測定參照馮宗慈等的比色法進行測定[7]。

揮發性脂肪酸(VFA)測定參照秦為琳的方法[8]。

1.6 數據統計分析

試驗數據采用EXCEL2003整理，運用SPSS18統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行統計分析，差異顯著則用DUNCAN法進行多重比較。當P<0.05時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼料桑粉營養成分分析

由表3可看出，飼料桑粉的干物質為91.38%、粗蛋白質18.29%、粗脂肪1.32%、粗纖維21.4%、鈣2.33%、總磷0.16%、粗灰分13.84%和總能為15.85 MJ/kg。其中干物質含量、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣均比相同質量的牛用全價精料中含量高，二者的總能則基本無差異。由此可知，飼料桑綜合營養比牛用全價精料要高。

表3 飼料桑營養成分(風干基礎)

2.2 飼料桑粉安全性評價

從表4可以看出，飼料桑粉中鉻含量為4.32 mg/kg，鎘含量為0.40 mg/kg，均在國家飼料衛生標準GB13078-2017規定范圍內，說明供試飼料桑粉作為飼料是安全的。

表4 飼料桑粉安全性評價指標)

2.3 飼料桑粉和牛用全價精料對體外培養發酵產氣量、pH、菌體蛋白及氨態氮指標的影響

ST組(飼料桑)在發酵時間點2 h、4 h、12 h時產氣量均顯著高于JT組(牛用復合精料)的產氣量(表5)，但是時間點8 h、24 h時ST的產氣量略低于JT組，但無顯著差異；ST組在0-8 h為產氣量上升最快的時間段，8 h之后產氣量增長速度減慢，12-24 h趨于平緩；JT組在0-2 h產氣量較少，2-8 h為產氣量上升最快的時間段，8 h之后產氣量增長速度減慢，12-24 h趨于平緩。而飼料桑的12 h、24 h的累計產氣量均顯著高于牛用全價精料產氣量(P<0.000 1)。

表5 飼料桑粉和牛用全價精料體外瘤胃發酵情況

項目時間/h不同處理組STJTP產氣量/mL217.77±8.39a9.87±0.71b<0.01426.49±0.91a17.89±0.90b<0.01838.94±0.9839.13±0.190.571221.22±0.50a18.60±0.56b0.012413.08±0.3714.35±0.620.1612 hT12 h累積產氣量104.02±1.76a85.50±1.14b<0.0124 hT24h累積產氣量115.06±0.52a97.96±0.39b<0.01pH125.55±0.01a4.78±0.02b<0.01245.41±0.01a4.63±0.01b<0.011干物質消失率/%1254.08±0.72b61.93±0.58a0.042456.30±0.26b62.97±0.12a0.01菌體蛋白/mg·mL-1123.55±0.03a1.91±0.04b<0.01243.08±0.232.51±0.170.12氨態氮/mg·dl-11211.54±0.60a3.88±0.30b<0.012416.16±0.92a6.57±0.33b0.01

從表5可以看出，ST組與JT組的發酵液的pH在12 h、24 h均存在顯著差異，即ST組的pH顯著高于JT組。ST組發酵液的pH在12 h、24 h時為5.55±0.01、5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范圍5.5～7.5，而JT組發酵液的pH在12 h、24 h時為4.78±0.02、4.63±0.01，則顯著降低了發酵液的pH值，說明飼料桑粉對瘤胃液pH值波動負面影響較牛用全價精料顯著偏低。

ST組的干物質消失率在12 h、24 h時均顯著低于JT組的干物質消失率，這應該是與飼料桑粗纖維含量顯著高于牛用全價精料之故。

ST組在發酵12 h時，發酵液菌體蛋白含量顯著高于JT組發酵液中的含量；而到發酵24 h時，其菌體蛋白含量稍高于JT組發酵液中的含量，但不存在顯著性差異。

ST組發酵液中氨態氮含量則在12 h、24 h時均顯著高于JT組發酵液中的氨態氮含量。

2.4 飼料桑粉和牛用全價精料對體外培養發酵揮發性脂肪酸的影響

從表6中可以看出，發酵到12 h時，ST組發酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總揮發性脂肪酸含量在發酵到12 h時，略低于JT組發酵液中的含量，但均無顯著差異；而發酵到24 h時，ST組發酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總揮發性脂肪酸含量顯著低于JT組的含量，乙丙比(乙酸/丙酸)則在發酵12 h、24 h時兩者均無顯著差異。ST組在發酵過程中，乙酸、丙酸、總酸含量在24 h均比12 h時降低近一半，而丁酸含量則從1.17±0.05增加到4.78±0.57；JT組發酵液的乙酸、丙酸、總酸含量在24 h時均比12 h增加近1倍或1倍以上。

表6 飼料桑粉和牛用全價精料體外瘤胃發酵情況

項目時間/h不同處理組STJTP乙酸/mmol·L-11263.69±3.8080.80±14.880.332436.94±3.18b146.50±1.08a<0.01丙酸/mmol·L-11222.79±1.5926.49±1.340.1512412.46±0.53b51.96±1.48a<0.01丁酸/mmol·L-1121.17±0.051.67±0.270.14244.78±0.57b16.48±1.61a0.00總揮發性脂肪酸TVFA/mmol·L-11287.64±4.89108.96±15.530.262454.18±2.32b214.94±1.69a<0.01乙酸/丙酸122.81±0.163.03±0.500.69242.99±0.372.82±0.080.68

3 討論

3.1 飼料桑的營養成分及安全評價

已有調查研究表明，在不同地區、不同生長季節、不同品種、不同種植方式等條件下的桑葉營養成分差異較大。據相關文獻報道[9]，桑葉中粗蛋白含量 16%～30% ，粗纖維 8%～12%，粗脂肪4%～10% ，灰分 8%～12% ，磷0.3%～0.6%，鈣 1%～3%。桑葉中還含有非特異性抗菌成分，能提高機體免疫能力、抗菌等作用[10]，桑葉作為飼料也無抗藥性，能激發機體抗病因子，不引發病菌變異，故桑葉飼料能增強動物機體新陳代謝，促進蛋白質和酶的合成，促進動物體生長，提高繁殖力和生產性能。本研究采用的原料為在重金屬污染土地上種植的飼料桑桑葉。粗蛋白含量偏低，粗纖維含量則明顯偏高，有可能與桑葉采摘時間，長在特殊土壤等相關，具體原因有待進一步研究分析。盡管該飼料桑種植在重金屬污染的土壤上，其桑葉的重金屬含量符合飼料原料標準。可見，飼料桑在治污、喂畜上發揮其作用，并在一定程度上緩解人畜爭糧的矛盾。

3.2 飼料桑和牛用全價精料體外瘤胃發酵特性

產氣量是衡量飼草營養價值的重要指標，是一個綜合反映飼料中有機物可發酵程度的指標，體外發酵產氣量則反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，與飼料中碳水化合物消化率高低有關，是評價反芻動物瘤胃發酵的一個重要指標。本試驗中兩種飼料樣品體外發酵產氣量動態變化曲線表明，飼料桑的初始產氣速度較快，而牛用全價精料初始階段可能因發酵不完全，產氣量相對較少，之后產氣速度加快，超過一定時間后產氣速度又逐漸下降，到24 h時，產氣速度趨于平穩。本試驗中，飼料桑在發酵時間點2 h、4 h、12 h時產氣量均顯著高于牛用復合精料的產氣量，其在12 h、24 h的累計產氣量也均顯著高于牛用全價精料產氣量，有研究表明[10]非纖維性碳水化合物含量與發酵速度呈正相關的結論，有可能是飼料桑中的非纖維性碳水化合物含量比牛用全價精料中的要高。本研究中飼料桑葉比牛用全價精料的產氣量顯著提高，說明飼料桑更易于發酵，與張桂杰[12]等研究的不同發育期的豆科牧草有相似的產氣性能，從這個角度講，飼料桑的飼用價值比牛用全價精料要高。

pH是反映瘤胃穩定性的重要指標。日糧的結構是影響 pH 的主要因素，過高或過低對瘤胃微生物的生長、發育和發酵都會產生影響[13]，正常瘤胃液pH范圍5.5～7.5。pH 越低，說明發酵所產的酸累積得越多。本試驗中,飼料桑發酵液的pH在12 h、24 h時為5.55±0.01，5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范圍5.5～7.5，顯著高于牛用全價精的4.78±0.02，4.63±0.01，可見，飼料桑對瘤胃液pH值影響要比牛用全價精料小很多。

體外干物質消化率反映了評價飼料消化的難易程度[14]，與飼料中NDF和ADF的含量有關。文亦芾[15-16]等的研究結果表明體外干物質消化率與NDF和ADF的含量呈極顯著負相關。靳玲品[17]的研究則表明，干物質消化率與粗蛋白質含量呈負相關。本試驗中飼料桑葉和牛用全價精料的消化率都很高，在發酵12 h和24 h后分別為54.08%、61.93%和56.30%、62.97%。飼料桑葉的干物質消化率在發酵12 h和24 h時均顯著低于牛用全價精料的消化率，應該是與飼料桑中較高的粗纖維和粗蛋白含量相關。

Owens[18]等認為，瘤胃微生物菌體蛋白合成水平受氨態氮含量的限制，且需要VFA提供能量，在一定范圍內，瘤胃內的能氮比例合適時，微生物菌體蛋白的合成效率最大。本試驗中，飼料桑的菌體蛋白在12 h、24 h時均高于牛用全價精料，在12 h時兩者差異顯著，表明添加飼料桑的發酵液中微生物活性比添加牛用全價精料大，即飼喂飼料桑后，瘤胃微生物合成菌體蛋白的能力高于飼喂牛用全價精料。氨態氮濃度也是評價瘤胃內環境的重要指標[19]，其反映了蛋白質合成與降解所達到的平衡狀況[20]。本試驗在發酵12 h時，飼料桑和牛用全價精料的NH3-N濃度分別為11.54 mg/dl，3.88 mg/dl；24 h時，分別為16.16 mg/dl和6.57 mg/dl，在12 h和24 h時，飼料桑的NH3-N濃度均顯著高于牛用全價精料的NH3-N濃度。

VFA的總產量等可顯著影響反芻動物對營養物質的吸收與利用，是反芻動物主要的能量來源[21]。本試驗中，產氣量較高的飼料桑粉的總揮發性脂肪酸濃度在12 h卻比牛用全價精料低，在24 h時則顯著低于牛用全精料的總揮發性脂肪酸濃度， 這與張元慶[22]等的研究結果不一致；也有研究表明乙酸/丙酸值的大小與能量利用效率成線性相關[23]，本試驗中發酵到12 h時，飼料桑的該比值略低于牛用全價精料比值；但在24 h時，飼料桑的該比值略高于牛用全價精料比值，但都無顯著差異，說明二者能量利用效率無差異。

4 結論

與牛用全價精料相比，飼料桑葉具有較高的粗蛋白質和粗脂肪含量、相對容易發酵且發酵過程中微生物蛋白質合成率高，pH和氨態氮水平也更符合反芻動物瘤胃內環境。綜上可以初步得出結論：飼料桑葉具有較高的營養價值，可以作為反芻動物的精飼料用于日糧中，但其最適添加比例有待進一步研究探討。