宏基因組學在酸性礦山廢水中的研究進展及應用

陳炬蓉 江夏薇 劉文洪

摘要：宏基因組學在探索新的基因和物種、調查微生物群落結構和功能上取得了很大成就，被廣泛應用于各個領域。本文以酸性礦山廢水為例，論述宏基因組學技術在環境中微生物群落結構以及抗生素抗性基因分布研究中的應用。

關鍵詞：宏基因組學;微生物群落結構;AMD;抗性基因

宏基因組學在探索新的基因和物種、調查微生物群落結構和功能上取得了很大的成就，廣泛地應用于各個領域。酸性礦山廢水（Acidminedrainage，AMD）中含有很高濃度的硫酸根以及有毒的重金屬離子，會造成地表水和地下水的污染，同時也危及人類的生命健康[1]。為了防控這種污染的進一步危害，需要了解AMD中微生物群落的組成結構以及適應環境變化的能力[2]。因此，本文以宏基因組學在AMD環境微生物群落結構及抗生素抗性基因分布研究中的應用為主，進行綜合論述。

一、宏基因組學概述

目前，較完善的組學方法是以高通量測序技術（羅氏454測序技術和Illumina測序技術）和基因芯片（GeoChip）技術為主要技術的宏基因組學。基因芯片技術用核酸序列檢測核酸探針雜交，能夠有所側重地得到已經知道的物種或者他們發揮作用的基因信息。通過系統分析，可以知道這個物種或作用分布在哪里，這過程中會遇到功能基因的干擾，無法發現未知基因有哪些相似點，故難以定義到新基因，更無法估算生物環境中的物種和個體總量。若合理利用高通量測序技術，將比較容易地獲得某一特定基因的大量操作分類單元（OTU）及其個體數量或者宏基因組中的大片段DNA信息，以此近一步深入了解生境中微生物群落的組成、結構以及遺傳進化關系等。兩種技術不僅能互相填補優缺點，共同為研究提供大量數據，還是原位微生物群落功能結構和代謝功能的數據來源。

二、宏基因組學在AMD研究中的應用

（一）AMD環境下微生物群落結構研究

傳統意義上，針對微生物群落的分析方法是先對微生物進行分離，然后鑒定微生物的生理生化性質，以此判斷出微生物所屬種類。在酸性環境中與利用微生物催化的浸礦技術中，有著許多自養型嗜酸性細菌，這些細菌需要在自然的環境下才能存活，靠著人工的固體培養基是無法存活的。實際上，熒光原位雜交法（FISH）、變性梯度凝膠電泳法（DGGE）和PCR克隆法等一些生物技術，都被用于研究傳統微生物群落的多樣性。但是在分析微生物群落結構和活動的分子生物學方面，這些研究方法有著勞動強度過大的嚴重缺點。因此運用最多的是基因芯片技術[1]。

而微生物法運用自然環境的硫循環原理，把重金屬離子緩慢儲藏在微生物體內。具體過程為先進行硫酸鹽還原菌的生物還原反應，然后把硫酸鹽一步步變為單質硫。國外許多研究人員利用微生物法處理礦山酸性廢水，如美國蒙大拿州有人嘗試將硫化還原菌運用到礦山酸性廢水處理中，最終讓出水pH值成功控制在7.0左右，且Fe、Al、Cd和Cu的去除率也很高[3]。國內處理含硫酸根的酸性廢水時，常采取石灰乳中和的方法，若酸性廢水的pH值低于正常值，原先的石灰乳中和法在處理每噸廢水時所需石灰量大、處理成本高，還會產生許多廢渣，可能帶給環境二次污染[4-5]。

（二）抗性基因研究

基因是遺傳信息的載體，可以實現自我復制，將遺傳信息傳給下一代。AMD寡營養生態系統中的微生物群落中有著能夠和重金屬脅迫、酸脅迫以及胞內氧化相抵抗的有關基因，能夠讓微生物擁有抵抗力，在外界極端條件情況下存活[7]。而比起抗生素抗性基因的研究，現階段重金屬抗性基因在各種環境中的傳播、分布特征及轉歸機制的研究少之又少[8]。

2.2.1 AMD中存在的天然抗性基因

在AMD中起抑制作用的重金屬離子可以毒化細菌的生長，但因為生長環境比較特殊，這讓浸礦微生物有較高的抵抗能力對抗許多金屬離子，這也使得A.ferroxidans被用來浸出鈾礦、銅礦、鎳礦等多種金屬硫化礦。有學者發現古菌與其他細菌之間的差異，主要是在氫離子脅迫的相關基因上與其他種群相比有較高的表達，這可以得出古菌在pH低的脅迫下可以更好的適應這種狀態，分析的原因可能是古菌雖然不斷的進化，但是卻留下了能夠抵抗氫離子脅迫的原始基因[8]。

2.2.2 抗生素、重金屬抗性基因獲得方式

現有研究表明，在質?；蜣D座子中，找到了能與重金屬對抗的抗性基因，并且細菌得到抗性基因的方式是通過抗性基因的水平轉移[8]。如SXT/R391家族中可變區基因的編碼產物對抗宿主抗生素的耐藥性、重金屬離子抗性等，有著高轉移頻率和寬宿主范圍[9]。

研究表明，在AMD中長期存在的生物具有一些比較特別的基因存在（例如參與重金屬抵御的基因）。根據16SrRNA基因的信息發現，這些生物高度相似于新形成的在AMD環境中的微生物，但是在地理方面，有很遠距離。這種微生物間的遷移機制目前還沒有發現奧秘，譜系間跨越時間尺度地理隔離的生存模式的相互關系卻可能依賴于此[9]。

2.2.3細菌抗生素抗性與重金屬抗性

2.2.3.1協同抗性

有著相同抗性遺傳載體的抗生素抗性基因和重金屬抗性基因，這兩種抗性基因的相關性是正相關，一種增多，另一種會隨之增多。例如鏈霉素抗性基因（strB）和汞抗性基因（merE）這兩種抗性基因在質粒pHCM1上存活，故其中任意一個基因的增加，緊跟著另一個基因會相同規模的增加[10-12]。

2.2.3.2交叉抗性

細菌細胞需要在相同抗性系統中，才能形成抗生素和重金屬的抗性。比如：TetL蛋白在向外界排出四環素（Tet）的同時，還能排出Co2+。

2.2.4 外界PH值同抗酸基因表達的優劣地位

微生物在AMD不斷酸化的過程中的作用主要在于通過鐵硫氧化降解礦物獲得能量，導致pH持續降低，到一定閾值時，由于其抗酸基因表達并不強勢，導致優勢地位可能逐步減弱的假設[11]。

三、 總結

宏基因組學不單單用傳統意義上的純培養技術，而是用非培養的方法，在有機選擇新的生物活性物質的機率上有了進步，許多新的生物活性物質（酶和抗生素等）利用該方法得以發現。

宏基因組學在探索新的基因和物種、調查微生物群落結構和功能上取得了很大的成就。在微生物領域和環境科學與工程領域內，已經變成了一個熱點和前沿內容，比如全球氣候變化、生物地理分布、海洋環境研究、農業生態系統、人體共生微生物等，特別是生物修復和資源開發，每一處都彰顯出其強大的潛力。

參考文獻：

[1]Zhang R B，Wei M M，Ji H G，et al.Application of real—time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（6）：116l-1168.

[2]詹婧.自然生態恢復過程中銅尾礦廢棄地微生物學性質及細菌群落結構研究[D].合肥：安徽大學，2010.

[3]宣淮翔.銅尾礦不同氧化層中為生物多樣性研究[D].合肥：安徽大學，2011.

[4]Hitch TCA， Thomas BJ， Friedersdorff JCA， et al. Deep sequence analysis reveals the ovine rumen as a reservoir of antibiotic resistance genes[J].Environmental Pollution，2018，235：571-575.

[5]Haley B J， Kim S W， Cao H， et al. 265 Genomic and metagenomic analysis of antibiotic resistance in dairy animals[J].Journal of Animal Science，2017，95（S4）：131.

[6]Ju F， Zhang T. Experimental design and bioinformatics analysis for the application of metagenomics in environmental sciences and biotechnology[J].Environmental Science&Technology，2015，49：12628-12640.

[7]孫欣，高瑩，楊云鋒.環境微生物的宏基因組學研究新進展[J].Biodiversity Science，2013，21（4）：393-400.

[8]韓玉姣.凡口鉛鋅尾礦酸性廢水微生物宏基因組及宏轉錄組研究[J].廣東：中山大學，2013.

[9]周圍，李友國，程國軍，等.1株抗重金屬鉻細菌的分離?鑒定及抗性基因型的初步研究[J].華中農業大學學報，2008，27（2）：248-250.

[10]羅鵬，何香燕，胡超群.細菌整合性接合元件SXT/8391研究進展[J].微生物學，2014（5）：472-473.

[11]宋超，鄭春麗，王建英.微生物硫酸鹽的同化途徑及其與重金屬抗性的關系[J].安徽農業科學，2012，40（11）：6368-6370，6400.

作者簡介：

陳炬蓉（1997—）女，籍貫：浙江麗水，本科在讀，研究方向：預防醫學。