柴胡注射液有效成分的血藥濃度測定

謝歡 譚茹月 鄧晶晶

[摘要] 目的 建立采用高效液相色譜（HPLC）進行大鼠血漿中柴胡注射液有效成分柴胡皂苷d濃度測定的方法。方法 取SD雄性大鼠6只，腹腔注射柴胡注射液5 mL/kg，并在不同時間點尾靜脈取血，以乙酸乙酯沉淀蛋白法處理血樣，并采用HPLC法測定柴胡皂苷d的血藥濃度。色譜柱為SWELL Chromplus C18（250 mm × 4 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（梯度洗脫），紫外檢測波長為204 nm，柱溫：30℃，流速1 mL/min。 結果 大鼠血漿中柴胡皂苷d的線性范圍為0.1～2 mg/mL（r = 0.9955）;低、中、高3個濃度準確度回收率分別為92.95%、105.52%、97.86%，日內及日間精密度RSD值均<6%，檢測限為2 μg/mL。低、中、高3個濃度血漿樣品在室溫放置12 h、-20℃冰箱冷凍保存10 d，反復凍融3次等情況下的穩定性均較好。 結論 該方法準確度高，重現性好，適用于柴胡皂苷d血藥濃度的測定。

[關鍵詞] 柴胡注射液;柴胡皂苷d;高效液相色譜法;血藥濃度

[中圖分類號] R969.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（c）-0123-04

Determination of blood concentration of active component in Bupleurum Injection

XIE Huan? ?TAN Ruyue? ?DENG Jingjing

School of Pharmacy， Chengdu Medical College， Sichuan Province， Chengdu? ?610500， China

[Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of saikosaponin d of Bupleurum Injection in rat plasma. Methods Six SD male rats were intraperitoneally injected with Bupleurum Injection of 5 mL/kg， and the blood was collected from the tail vein at different time points. The blood samples were treated with ethyl acetate precipitated protein method， and the blood concentration of saikosaponin d was determined by HPLC. The column Swell chromplus-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used as the column. The mobile phase was water-acetonitrile （gradient elute）， the detection wavelength was 204 nm， the column temperature was 30℃ and with the flow rate of 1.0 mL/min. Results The linear range of saikosaponin d in rat plasma was 0.1-2 mg/mL （r = 0.9955）. The accuracy recovery rates of low， medium and high concentrations were 92.95%， 105.52% and 97.86%， respectively. The RSD values of intra-day and intra-day precision were all < 6%， and the detection limit was 2 μg/mL. Plasma samples with low， medium and high concentrations were kept stable for 12 h at room temperature， frozen at -20℃ for 10 d， and repeatedly frozen and thawed 3 times. Conclusion The method is accurate， specific， and suitable for the determination of saikosaponin d of Bupleurum Injection in rat plasma.

[Key words] Bupleurum Injection; Saikosaponin d; High performance liquid chromatography; Plasma concentration

柴胡注射液是傘形科植物北柴胡的干燥根經水蒸氣蒸餾制成的水溶液[1-2]，常用于治療流行性感冒、瘧疾等疾病引起的發熱[3]。隨著柴胡注射液在臨床上的應用日益增加，其注射后產生的神經系統反應、肝腎損傷、過敏性休克等不良反應的報道也隨之增加[4-9]，因此，對該藥物質量控制方面的深入研究顯得尤為重要。

目前對柴胡注射液的研究多為體外主要成分測定[10-13]及解熱機制[14-15]等方面的內容，對其體內的血藥濃度測定鮮見報道。本研究以柴胡皂苷d為檢測指標，測定其血藥濃度，探討柴胡注射液中柴胡皂苷d在大鼠體內變化過程。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;CPA225D電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）;JPN200氮吹儀（上海繼譜電子科技有限公司）。

1.2 試藥

柴胡注射液（神威藥業集團有限公司，規格：2 mL/支，批號：17052611、17110908、17120812）;0.9%的氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：L21909 0110）;肝素（國藥集團化學試劑有限公司，批號：2017 0426）;柴胡皂苷d對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17050106，純度：≥98%）。

1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠，體重（200±20）g，6周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司[合格證號：SCXK（川）2018-0024]。大鼠飼養于成都醫學院SPF級動物房，室內溫度20～26℃，相對濕度為40%～60%。在給藥前12 h開始禁食，自由飲水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SWELL Chromplus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min ;檢測波長：204 nm;進樣量：20 μL;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min：5%～13%A;5～20 min：13%～16%A;20～25 min：16%～25%A;25～35 min：25%～40%A;35～40 min：40%～55%A;40～50 min：55%～65%A）。

2.2 柴胡皂苷d對照品儲備液的配制

精密稱取柴胡皂苷d對照品40 mg，用甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，制成4 mg/mL的柴胡皂苷d對照品貯備液，保存于-4℃冰箱中，備用。

2.3 給藥方法及樣品采集

SD雄性大鼠6只，體重（200±20）g，給藥前12 h禁食，不禁水，腹腔注射柴胡注射液5 mL/kg，尾靜脈取血0.5 mL放于肝素浸潤過的EP管內，4000 r/min離心5 min，取血漿0.2 mL轉移至另一EP管中，于-20℃冰箱保存，待測。

2.4 血漿樣品的處理

在0.2 mL血漿樣品中加入0.8 mL乙酸乙酯去蛋白，渦旋3 min，5000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至1.5 mL EP管中，40℃氮氣吹干，加入乙腈0.2 mL復溶，渦旋3 min，進行高效液相色譜（HPLC）分析，進樣前用0.22 μm的微孔濾膜濾過。

2.5 方法學的驗證

2.5.1專屬性? 取空白血漿樣品0.5 mL，按“2.4”項下方法處理，并按“2.1”項下HPLC色譜條件測定;取“2.2”項下對照品儲備液適量，用甲醇稀釋至濃度為0.2 mg/mL的柴胡皂苷d標準溶液，按照“2.1”項下條件測定，柴胡皂苷d的保留時間為42.621 min;將0.2 mg/mL的柴胡皂苷d加入到0.1 mL空白血漿中，同法測定，柴胡皂苷d的保留時間為42.787 min;取大鼠給藥后采集的血漿樣品0.2 mL，依法操作，所得含藥血漿樣品柴胡皂苷d保留時間為42.478 min，對照品與含藥血漿樣品的色譜圖中，柴胡皂苷d的色譜峰保留時間一致，同時血漿中的雜質不影響其測定。柴胡皂苷d的保留時間在42.5 min左右，其峰形良好，雜質峰影響較小。見圖1。

2.5.2 線性范圍? 精密吸取100 μL的大鼠空白血漿6份，分別依次加入“2.2”項下對照品儲備液適量，按照“2.4”項下方法進行前處理，制得一系列濃度的含藥血漿。隨后按照“2.1”項下的條件測定。以血漿中柴胡皂苷d的濃度為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y = 1784.3 X+35.47（r = 0.9955），標準曲線的測定結果見表1。結果顯示，在0.1～2 mg/mL的濃度范圍內兩者呈現良好的線性關系，r = 0.9955（n = 6），定量下限為0.1 mg/mL。

2.5.3 準確度與精密度的測定? 取大鼠空白血漿100 μL，加對照品儲備液分別配置低、中、高3個濃度（分別為0.2、0.8、2.0 mg/mL）的柴胡皂苷d的標準血漿樣品溶液，每個濃度5份樣品，按“2.4”項下方法處理后再按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積。連續測定3 d，根據當日的標準曲線，計算出柴胡皂苷d的濃度，并考察方法的準確度、日內精密度及日間精密度，見表2。結果顯示該方法的準確度、日內精密度及日間精密度均符合方法學驗證要求。

2.5.4 提取回收率測定與檢測限的測定? 取大鼠空白血漿100 μL，加入對照品儲備液分別配制成“2.5.3”項下低、中、高3種濃度的血漿樣品，每個濃度5份樣品，按“2.4”項下方法處理后再按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積為A。另取空白血漿，按“2.4”項下方法處理后，分別加入低、中、高3種濃度的柴胡皂苷d對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積為B。按A/B×100%計算柴胡皂苷d低、中、高3種濃度的提取回收率分別為75.64%、82.31%、88.97%，各濃度水平的RSD≤6.43%（n = 5）。以1 mg/mL柴胡皂苷d標準溶液為基礎無限稀釋數倍，同法測定記錄峰面積，以信噪比等于3時對應的血漿中的柴胡皂苷d的濃度為本方法的檢測限，結果顯示，大鼠血漿中柴胡皂苷d經本法測定的的檢測限為2 μg/mL。

2.5.5 穩定性考察? 取大鼠空白血漿100 μL，加對照品儲備液分別配置成如上低、中、高3個濃度的柴胡皂苷d的標準血漿樣品溶液，每個濃度5份樣品，按“2.4”項下方法處理后再按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積。分別考察含藥血漿在室溫放置8 h（0、2、4、6、8 h）、-20℃冰箱冷凍保存10 d，反復凍融3次等情況下對穩定性的影響，見表3，結果顯示該方法在上述條件下穩定性良好。

2.6 血漿樣品中柴胡皂苷d含量的測定

取大鼠血漿樣品按“2.4”項下方法處理后再按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積并計算血藥濃度，30 min時的血藥濃度為0.637 mg/mL，45 min時的血藥濃度為0.852 mg/mL，75 min時的血藥濃度為1.884 mg/mL，120 min時的血藥濃度為0.680 mg/mL，150 min時的血藥濃度為0.549 mg/mL。

3 討論

確定給藥劑量時，按照人與大鼠間體表面積折算的等效劑量比值所得，普通成人體內注射劑量為4 mL，推算大鼠注射劑量應為0.024 mL，但實驗結果顯示此劑量在腹腔注射時濃度過低，且取樣量太小不易于操作，故查閱相關文獻[1，10]后并結合預實驗結果，腹腔注射的用藥劑量為5 mL/kg。

在血漿樣品前處理時，本研究嘗試了采用乙腈和乙酸乙酯分別沉淀蛋白，結果顯示，乙腈沉淀蛋白后的血漿樣品有較多的白色不溶性雜質，且色譜圖上雜質峰較多;采用等量乙酸乙酯沉淀蛋白后幾乎未見雜質的沉積，且色譜圖上雜質峰也相對較少，故本研究最終采用乙酸乙酯沉淀蛋白。

在HPLC確定檢測波長時，根據文獻[16-20]，204、208 nm和210 nm都可作為柴胡皂苷d的測定波長。本研究在對柴胡皂苷d標準品進行紫外掃描時，結果顯示204、208、210、278 nm處均有吸收，其中204 nm處吸光度最大，且無其他色譜峰干擾。以278 nm作為檢測波長時，血漿樣品測定結果顯示無明顯吸收;以208、210 nm作為檢測波長時，血漿樣品溶液和體外標準品溶液的測定圖譜顯示柴胡皂苷d吸收峰均不及204 nm時測定的高，故最終選擇204 nm作為檢測波長。

本研究采用HPLC法建立了在大鼠血漿樣品中柴胡注射液的柴胡皂苷d含量的測定方法，結果顯示該法回收率高，重復性和穩定性好，后續可用于柴胡注射液中柴胡皂苷d的藥動學研究。

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（收稿日期：2019-10-11? 本文編輯：劉永巧）