基于網絡藥理學探討左金丸治療胃癌前病變機制

涂華 胡運蓮

[摘要] 目的 運用網絡藥理學方法研究左金丸治療胃癌前病變（GPL）的可能機制。 方法 通過TCMSP數據庫獲取左金丸的活性成分，利用TCMSP、Pharmmapper獲得活性成分對應的靶點，利用Gene Card獲得GPL的相關靶點，取共有靶點使用String、Cytoscape構建PPI網絡圖，并利用David對所獲靶點進行通路富集分析。 結果 左金丸中有41種活性成分對應636個靶點，GPL共有1352個靶點，左金丸與GPL共有靶點165個，GO生物過程富集顯示左金丸與GPL共有靶點參與轉錄調控、藥物結合、細胞凋亡等多項生物過程，KEGG富集顯示共有靶點在癌癥通路、PI3K-Akt通路等有明顯富集。 結論 左金丸可以通過多靶點、多通路治療GPL，為今后研究提供參考依據。

[關鍵詞] 網絡藥理學;左金丸;胃癌前病變;富集分析

[中圖分類號] R256.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（c）-0155-05

Exploration on the mechanism of Zuojin Pills in the treatment of gastric precancerous lesions based on network pharmacology

TU Hua1，2? ?HU Yunlian1，2

1.Department of Spleen and Stomach Diseases， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan? ?430061， China; 2.Department of Spleen and Stomach Diseases， Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan? ?430074， China

[Abstract] Objective To study possible mechnism of Zuojin Pills in the treatment of gastric precancerous lesions （GPL） using network pharmacology. Methods The active components of Zuojin Pills were obtained by TCMSP database， the corresponding targets of the active components were obtained by TCMSP and Pharmapper， the related targets of GPL were obtained by Gene Card， the common targets were obtained， the PPI network map was constructed by String and Cytoscape， and the targets were analyzed by David. Results There were 41 active components corresponding to 636 targets in Zuojin Pills， 1352 targets in GPL， 165 targets in Zuojin Pills and GPL. The enrichment of GO biological process showed that Zuojin Pills and GPL were involved in transcription regulation， drug binding， cell apoptosis and other biological processes. The enrichment of KEGG showed that the common targets were obviously enriched in cancer pathway， PI3K-Akt pathway， and so on. Conclusion Zuojin Pills can treat GPL through multiple targets and multiple pathways， so as to provide reference for future research.

[Key words] Network pharmacology; Zuojin Pills; Gastric precancerous lesions; Enrichment analysis

胃癌前病變（GPL）是病理學指慢性萎縮性胃炎向胃癌過渡的一個過程。隨著社會的迅速發展，胃癌的發病率也逐步提升，研究顯示，胃癌是全球第四大常見的惡性腫瘤，在癌癥相關死亡率位居第二位，預測顯示，到2040年中國胃癌將新增近120萬，死亡病例將達到約110萬，嚴重威脅全球健康水平[1-2]。因此控制發病危險因素，預防癌變成為臨床亟待解決的問題。左金丸出自《丹溪心法》，有清肝瀉火、降逆止嘔的功效，臨床常用于治療消化系統疾病。左金丸雖然只有兩味藥，但具有辛開苦降、調和肝胃的作用，同時具有寒熱并用、攻補兼施的特點，是臨床治療寒熱錯雜病證的代表方。而在GPL階段基本病機和病理改變為肝脾（胃）不調（包括脾失健運、肝失條達、胃失和降），同時變生出寒熱虛實錯雜等病理情況。所以，治療GPL關鍵在于調和肝胃（脾）、辛開苦降，兼調寒熱，左金丸便由此法而立。網絡藥理學是一門綜合了藥學、生物學、計算機學等學科的新興交叉學科，突破了以往研究單一活性成分的局限，適應中藥復方多靶點的特性，體現了中藥組方的系統性，有助于闡明中藥的復方作用。本文運用網絡藥理學相關數據庫，對疾病、藥物信息進行收集和分析，從生物信息角度探討左金丸治療GPL可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選

將左金丸中黃連、吳茱萸輸入中藥系統藥理學分析平臺TCMSP，考慮到中藥一般經口服用，根據藥物動力學（ADME）的特點將口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件并將獲得活性成分。

1.2 藥物及GPL靶點篩選

利用TCMSP查詢靶點，將所有活性成分的靶點記錄下來。Pharmmapper是反向預測對接蛋白的工具，其匹配值（Fit）越高，越有可能成為分子靶點，以Fit≥3為基礎選擇靶點蛋白。Uniport是目前信息最豐富、資源最廣的蛋白數據庫，將上述所有靶點輸入并選擇物種為homo sapiens，獲得對應的基因名稱，進行基因標記。利用Gene Card獲得GPL的靶點。分別將左金丸靶點和GPL靶點比對篩選出共有靶點。

1.3 中藥-化合物-靶點、PPI網絡構建

String數據庫是一個搜尋蛋白質之間相互作用（PPI）的數據庫，除了反映蛋白質之間的相互作用外，還常常應用于預測結果。將共有靶點輸入數據庫，并選擇物種為homo sapiens，獲得相關信息。將上述所有獲得信息導入Cytoscape 3.6.1中進行可視化處理，并分析各靶點的相關拓撲參數。

1.4 基因本體生物論（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將靶點輸入David數據庫，獲取富集信息，分別取GO生物過程（BP）富集與KEGG富集利用選取P值最小的10條進行分析，利用R Studio對結果進行處理，繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 左金丸活性成分篩選

左金丸中共含有44種化合物，其中黃連14種，吳茱萸30種，刪除冗余后共有41種化合物。見表1。

2.2 左金丸與GPL靶點篩選及網絡構建

通過TCMSP、Pharmmapper獲得左金丸靶點有3036個，刪除冗余后獲得靶點636個。通過Gene Card獲得GPL相關靶點1352個，分別選取左金丸與GPL共有靶點165個，其中128個為黃連和吳茱萸共有靶點。利用Cytoscape建立左金丸-活性成分-靶點-GPL復雜網絡圖（圖1），共含209個節點，799條邊。圖中菱形代表GPL，方形代表中藥，V形代表活性成分，三角形代表共有靶點。

2.3 蛋白質互作網絡圖構建

將左金丸與GPL共有靶點導入String數據庫獲取相互作用關系，選擇最高置信度90%作為條件，后導入Cytoscape獲取蛋白質-蛋白質互作網絡圖（PPI圖，圖2）。將靶點按照Degree進行排序，取前20位列于左側。

2.4 GO富集分析與KEGG富集分析

將所獲左金丸與GPL共有靶點輸入David數據庫后，獲取富集信息，取左金丸與GPL靶點富集分析中P值最小10位進行分析如圖3（封三）所示，其中GO生物過程包括轉錄調控、增殖及凋亡調控、信號傳導等多項。KEGG富集顯示，共有靶點在癌癥通路（圖4）、PI3K-Akt通路等信號通路上有明顯富集。

3 討論

胃癌是一個漸進多步驟的過程，GPL是病變前的關鍵階段，進行藥物干預的重要時期[3]，目前GPL的治療主要有抗幽門螺桿菌、抗炎、抗氧化等，但不能從根源上逆轉向胃癌的轉變[4]。GPL主要表現為胃脘部飽脹感、痞悶，屬于中醫“胃痞病”范疇[5]。有研究表明，在肝胃不和型GPL與幽門螺桿菌感染、輕至重度腸化密切相關[6-7]。左金丸中黃連味苦而大寒，重用以清肝火而泄胃熱，佐以吳茱萸味辛而熱，和胃降逆，兩藥合用有“辛開苦降”之義，善治嘔吐吞酸、脅痛口苦之肝胃不和證，前期研究也提示，左金丸逆轉GPL進程的可能性[8-10]。網絡藥理學是在系統生物學、多向藥理學的基礎上發展而來，突破了原有藥物-靶點-疾病一一對應的模式，其系統性、多樣性、整體性與中醫的整體觀念相符合[11]。

研究顯示，左金丸中41種活性成分均參與GPL的治療，其中槲皮素對應的共有靶點有95個，遠超第2位巴馬汀對應的22個。槲皮素廣泛存在于各種植物當中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的特性，其所調控的CASP蛋白家族、BCL2、表皮生長因子（EGF）及血管內皮生長因子A（VEGFA）等均與癌癥的發病密切相關。近年來已有對其衍生物開展的抗腫瘤實驗的報道，并表現出良好前景[12-14]。

蛋白互作圖分析顯示Akt、MAPK1、TP53等蛋白在本病治療中均有中藥作用。Akt、TP53的活化與腫瘤的發生、發展密切相關，其在胃癌患者中存在過度表達，通過抑制其活化可以抑制病變[15-16]。

癌癥通路包含多條信號通路，且KEGG富集程度明顯高于其他通路，故而進一步對其富集靶點進行分析。左金丸主要通過表皮生長因子受體（EGFR）、胰島素樣生長因子（IGF）、Raf等參與MAPK信號通路調控細胞增殖。有研究證實，抑制慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠的EGFR表達可以有效抑制MAPK通路的異常激活，逆轉GPL[17]。研究認為，低氧微環境導致PTEN表達降低使PI3K-Akt相關通路激活，GPL向胃癌逐漸形成[18]，左金丸可能對通路中的PTEN、Akt、CASP9等影響干預細胞凋亡。HIF-1α被認為在GPL組織中高表達[19]，本研究中發現左金丸可以通過干預HIF-1α與血管內皮生長因子、轉化生長因子-β等參與構成的HIF-1信號通路調節血管生成。然而，不容忽視的是幽門螺桿菌感染也是GPL的病因之一，主要通過Hedgehog通路和Notch通路致病[20]。但本研究未發現左金丸參與調控的靶點，提示左金丸可能不能通過抑制幽門螺桿菌感染來治療GPL。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學手段對左金丸的藥理作用進行分析，初步揭示了其對GPL的多維調控網絡，本研究為之后本課題組后續工作的開展提供了前瞻性指引，進一步為中醫藥及復方機制的研究提供了理論參考。

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