不同楊樹品種DNA指紋圖譜特征研究

王興勝 林琪 曹龍 朱秋萍

摘? ?要：為豐富楊樹栽培品種的遺傳信息，收集了中國北方地區廣泛栽培的33個楊樹品種，進行指紋圖譜構建、系譜關系鑒定和遺傳多樣性分析。利用SSR技術對33份楊樹種質進行指紋圖譜構建和系譜關系鑒定。從楊樹SSR數據庫中選取22對SSR引物，挑選出4 對擴增條帶清晰、具有多態性且重復性好的引物，對33份楊樹種質進行篩選與鑒定，并構建指紋圖譜，利用NTEDIT.LINK進行聚類分析，其聚類結果與傳統分類學上的結果一致。研究表明，SSR 分子標記技術在楊樹品種鑒定中具有一定的可靠性，同時為開展楊樹資源遺傳親緣關系分析和雜種優勢等開發利用提供了重要的參考。

關鍵詞：楊樹品種;DNA指紋圖譜;特征

文章編號： 1005-2690（2020）10-0006-03? ? ? ?中圖分類號： S792.11? ? ? ?文獻標志碼： B

楊樹是我國重要的綠化樹種和能源樹種之一。楊樹為落葉喬木，分布廣泛且種類多種多樣。近年來，由于國家對林木繁育種業的高度重視，育種技術和楊樹速生優良新品種的選育速度也逐漸加快。但是，由于楊樹馴化歷史悠久，其生物學性狀受生長發育階段和環境因素的影響，僅通過形態學不利于新品種權的保護，并且作為品種區分標準實為困難。因此，采取植物的幼嫩部位提取DNA[1-2]，利用SSR分子標記技術進行遺傳多樣性分析并構建指紋圖譜，以此保證品種的特異性，為后期品種鑒定及良種審定提供有效信息。

1? ?材料和方法

1.1? ?材料

分布在新疆不同生態區域內的33個楊樹品種。

1.2? ?DNA提取

提取DNA采用改良CTAB法[3]。具體操作步驟如下。

（1）取幼嫩真葉材料一小片，用蒸餾水沖洗干凈，置1.5 mL的離心管中，加液氮，快速冷卻。

（2）將材料快速研磨成粉末，然后加入 65 ℃預熱的CTAB提取緩沖液700 μL。

（3）放入 65 ℃水浴30～40 min，每10 min 輕輕地振蕩一次。

（4）加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）700 μL，混勻5 min，12 000 rpm離心5 min。

（5）取上清液，轉入另一個1.5 mL新離心管中，加入預冷的無水乙醇800 μL， 放置于4 ℃靜置10 min左右，讓DNA充分沉淀。

（6）清除無水乙醇，加入預冷70%乙醇漂洗兩次。

（7）室溫晾干，輕輕彈離心管，至沒有水滴即可。

（8）將DNA溶于50 μL或100 μL的 0.1倍TE中，加入RNase（10 mg/mL）1 μL于37 ℃消化15～30 min。

（9）于-20 ℃或4 ℃條件下保存。

1.3? ?SSR標記引物序列的獲得及合成

通過引物篩選，將多態性豐富且穩定性好的SSR引物用于楊樹品種的鑒定及遺傳多樣性分析。具體篩選的引物組合見表1。

1.4? ?SSR反應體系

1.4.1? ?SSR標記技術楊樹擴增反應試劑反應體系

1.0 μL 330 ng/μL DNA、2.33 μL 10×Buffer（含Mg2+）、1.6 μL dNTPs（2.33 mM each）、0.33 μL 10 pM Forward primer、0.33 μL 10 pM Reverse primer、0.233μL 33 U/μL Taq polymerase、18.633 μLddH20，將上述反應物混勻后于PCR儀（PTC-200TM Peltiter thermal cycler）上進行擴增。

1.4.2? ?反應程序

94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，以上循環35次后，72 ℃ 10 min，最后放置10 ℃保存。

1.5? ?非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

6%聚丙烯酰胺凝膠配方：6 mL聚丙烯酰胺膠母液，2 mL 10×TBE超純水10 mL，200 μL10%過硫酸胺，20 μL TEMED。

1.6? ?銀染

通過固定、染色、顯色、漂洗一次，自然晾干后掃描。

1.7? ?讀帶記錄并分析

取出干燥后的凝膠，對其形成的DNA多態性圖譜進行讀帶，同一位置沒有條帶的記“0”，清晰的記“1”，生成“1”和“0”組成的原始矩陣。利用NTSYS-2.10e 軟件求Dice相似系數矩陣，用UPGMA方法進行聚類分析，最后生成聚類圖通過Tree plot模塊。

2? ?結果與分析

2.1? ?品種鑒定

利用22對SSR 引物對33份楊樹品種進行鑒定，挑選出了4對多態性較好的引物進行篩選和鑒定。結果表明：引物PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206分別擴增出（除15號和21號品種之外的）31個品種的特異性條帶。電泳結果見圖1，指紋圖譜見圖2。

2.2? ?遺傳多樣性分析

采用4對SSR引物對33份楊樹品種進行聚類分析，結果見圖3。

3? ?結論

通過SSR分子標記技術對33份楊樹種質建立指紋圖譜和鑒定系譜關系，結果表明：4種引物，包括PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206能夠較好地區分33份楊樹品種（除111和171號品種）。這些 SSR標記所構建的指紋圖譜，可用于楊樹品種的區分和鑒定。

參考文獻：

[ 1 ] 李榮旗，張開春，尹淑萍，等.從蘋果、山楂等果樹韌皮部快速微量提取總DNA用于RAPD分析（簡報）[J].農業生物技術學報，1997，5（1）：98-99.

[ 2 ] 王孝安，肖婭萍，胡雅琴.太白紅杉3種不同材料總DNA的提取[J].西北植物學報，2003，23（4）：641-644.

[ 3 ] 黃烈健，蘇曉華，張香華，等.與楊樹木材密度、纖維性狀相關的SSR分子標記[J].遺傳學報，2004，31（3）：299-304.