一株毒死蜱降解菌的分離與鑒定

齊芬芳 張金霞 牛熙

摘要：本研究從受毒死蜱污染的農田中取樣，分離得到一株毒死蜱高效降解菌株，該菌株最高能夠耐受1000mg·L^-1濃度的毒死蜱，72h對濃度100mg·L^-1毒死蜱的降解率為52.34%。通過形態學、生理生化和分子學方法對該菌株進行鑒定，確定為枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：毒死蜱;降解菌;分離;鑒定

自有機氯農藥在我國限用之后，有機磷農藥（organo-phosphorus pesticides，OPs）就成為生產及推廣使用最多的一種農藥，該農藥在環境中降解快、殘毒低，而且具有成本低、藥效高、種類多、藥害小、選擇性高、治理范圍廣、比有機氯農藥容易降解等優點。但有機磷農藥在土壤、水體、植物和動物體內殘留，可隨著食物鏈的富集進入人體，從而影響人類健康。研究有機磷農藥降解對于保護環境、促進人們健康具有重要意義。

1971年，首次有研究表明，微生物可降解OPs，由于殺蟲劑二嗪農的生物降解，有害病蟲褐飛虱的控制效率有所下降。繼而研究者通過富集、馴化、分離的純培養方法，篩選出多種能夠降解OPs的微生物，包括細菌、真菌、放線菌和藻類等，并對農藥的降解途徑以及代謝方式進行了研究。目前，農藥的微生物降解是指利用微生物的代謝過程使農藥的化學結構發生改變，使其由有害的大分子化合物降解為無害的小分子化合物，直至CO₂、H₂O，實現無害化降解的過程，具有降解速度快、降解效果徹底、環境影響小、處理成本低等特點。微生物降解作為一種高效清除農藥污染環境生物技術和目前降解OPs的主要手段，已成為OPs降解的研究熱點。

本研究以毒死蜱作為目標降解物，從自然環境中分離篩選高效降解菌株，為有機磷農藥微生物降解的進一步研究提供菌種資源和理論依據。

一、材料與方法

（一）土壤樣品

土壤樣品采集于貴陽市某農田。采樣深度為510cm。

（二）主要培養基及試劑

1、培養基。LB培養基：胰蛋白胨10g·L^-1;NaCl10g·L^-1;酵母粉5g·L^-1;H₂O1000mL（pH7.0）。如為固體平板則加入1.5%的瓊脂。將藥品倒入燒杯中，用玻璃棒攪拌使其完全溶解，用1mol·L^-1的NaOH調節pH值在7.0，再分裝至250mL三角瓶中，至高壓滅菌鍋中滅菌后使用。

毒死蜱無機鹽培養基：K₂HPO₄1.5g·L^-1;KH₂PO₄0.5g·L^-1;（NH₄）₂SO₄1.0g·L^-1;NaCl 1.0g·L^-1;Mg-SO₄.7H₂O 0.05g·L^-1;H₂O 1000mL（pH7.0）。農藥按需添加，如為固體平板培養基則加入1.5%的瓊脂。配置好后121℃滅菌20min備用。

2、主要試劑。毒死蜱原藥購自特安源生物科技公司;40%毒死蜱購自浙江東風化工有限公司;無水乙醇、二甲苯、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸、石油醚、過氧化氫、氫氧化鈉、肌酸等常規試劑均為國產分析純。瓊脂糖凝膠回收試劑盒由天根生化科技（北京有限公司）生產;引物由賽默飛世爾科技公司合成。

（三）菌株的富集與初篩

稱取土樣3g于毒死蜱無機鹽培養基中，在37℃搖床120r·min^-1培養5d，再以10%接種量轉入新鮮的毒死蜱無機鹽培養基中，培養基中毒死蜱濃度（mg·L^-1）為0、50、100、200。將最后一次培養液取樣進行梯度稀釋，涂布于毒死蜱無機鹽瓊脂平板，于37℃恒溫培養箱中培養。待長出單菌落時，挑取同批相比較大單菌落于添加50mg·L^-1毒死蜱的LB普通瓊脂平板上連續劃線5次純化菌落，直到菌落表面顏色、質地等形態特征完全一致，顯微鏡下進一步確定純種，對所得降解菌株進行保種。將純化菌株接種于100mg·L^-1的毒死蜱無機鹽培養基中，梯度增加毒死蜱濃度至1000mg·L^-1，篩選高效降解菌株。

（四）高效降解菌株的篩選

1、標準曲線的制定。根據毒死蜱在波長為292nm時有紫外特殊吸收峰的特性，通過分光光度法來確定在波長為292nm時樣品的吸光值。以石油醚為溶劑，配制1000mg·L^-1的毒死蜱母液。再根據需要稀釋成濃度（mg·L^-1）為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200的待測溶液。以石油醚為空白對照，采用紫外分光光度計在波長為292nm時測定吸光值，記錄毒死蜱濃度和對應的吸光值，重復三次。然后以毒死蜱濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制毒死蜱的標準曲線，求得回歸方程和R²。

2、降解菌種子培養液的制備。在LB液體培養基中富集篩選出的高耐藥性菌株，當菌液達到對數增長期時，吸取1.5mL培養液至離心管中，以10000r·min^-1離心1min收集菌體，用0.9% NaCl洗滌，分別懸浮于無機鹽液體培養基中。

3、降解菌降解率測定。將毒死蜱母液稀釋成100mg·L^-1，過濾除菌，加入到100mL滅菌無機鹽培養基中。以10%的接種量將種子液加入到100mg·L^-1毒死蜱無機鹽培養基中37℃120r·min^-1培養3d，以未加菌的毒死蜱無機鹽培養基作為空白對照，培養好的菌液為待測樣品。每處理重復三次。取待測液體培養基50mL，加石油醚50mL，振蕩4min，靜置分層;重復提取兩次，合并兩次提取液后吸取上清液用紫外分光光度計測取其OD292值，根據標準曲線得出培養液中毒死蜱的質量濃度，計算毒死蜱的降解率，以確定高效降解菌。降解效率公式為：

（五）高效降解菌株的鑒定

1、形態學鑒定。將菌株劃線于LB瓊脂平板上，37℃培養箱中培養16h，挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡下觀察菌體。

2、生理生化鑒定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》的方法，對篩選得到的高效降解菌進行生理生化試驗鑒定，包括葡萄糖發酵、乳糖發酵、蔗糖發酵、山梨醇發酵、淀粉水解明膠液化、MR、過氧化氫酶、V-P、檸檬酸鹽利用、接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原和吲哚試驗。

3、分子鑒定。試劑盒提取目的菌株總DNA，16SrDNA特異性引物進行擴增，引物序列為：P16SL：5'-GAGA-GTTTGATCCTGGCTCAG-3';P16SR：5'-GCCCCCGT-CAATTCCTTTGAG-3'。PCR反應條件為：95℃預變性5min;95℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸50s，30個循環;72℃延伸10min。PCR產物切膠測序。

測序后的16SrDNA序列在NCBI中Blast比對同源性。選擇同源關系較近的序列，采用MEGA7進行聚類分析，構建系統發育樹。

二、結果與分析

（一）高效降解菌的分離

以毒死蜱為唯一碳源，從受污染的農田土壤樣品中篩選出57株降解毒死蜱的菌株。純化后梯度增加毒死蜱濃度至1000mg·L^-1，分離到1株具有高耐藥性的降解菌株，編號為B19。

（二）降解效率的測定

采用紫外分光光度法測定標準濃度毒死蜱，以毒死蜱濃度為橫坐標（x），毒死蜱在292nm的吸光值為縱坐標（y），繪制毒死蜱的標準曲線（見圖1），得線性回歸方程為：y=0.0154x+0.0579，R²=0.9991，結果顯示在0～200mg·L^-1毒死蜱濃度范圍內有良好的線性關系，此線性方程可以用來計算樣品中毒死蜱的濃度。

將篩選出的高效降解菌株種子液以10%的接種量接種于100mg·L^-1的毒死蜱無機鹽液體培養基中，在37℃、120r·min^-1培養72h，利用石油醚萃取后用紫外分光光度計測量OD292，以計算降解率。菌株B19在100mg·L^-1毒死蜱中培養72h對毒死蜱的降解效率為52.34%。

（三）菌株的鑒定

1、菌株的形態。通過形態學觀察，對菌株B19形態特征（見圖2a、圖2b）進行描述，結果如下：菌落在LB培養基上為圓形或近圓形，呈皺褶狀，干燥（見圖2a）。制成裝片在顯微鏡下觀察為革蘭氏染色陽性菌，桿狀，末端圓（見圖2b）。

2、菌株的生理生化特征。對菌株B19進行生理生化試驗，特征見表1。結合生理生化特征，將該菌初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3、分子學鑒定。

（1） PCR擴增。提取菌株B19的基因組DNA作為模板，以16SrDNA的特異性引物進行擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，120v電壓電泳40min，出現900bp左右的條帶，切膠測序見圖3。

（2）測序結果分析。將菌株B19的16S rDNA核苷酸序列在NCBI中進行Blast比對，結果表明，菌株B19與枯草芽孢桿菌的同源性高達99%，說明該菌株在分子系統發育分類學上屬于枯草芽孢桿菌，學名為Bacillus subtilis。對該序列用MEGA7軟件中的鄰接法進行聚類分析（見圖4），可以看出其與枯草芽孢桿菌同源性最高，歸為同一支。綜合形態學及生理生化特征分析，將菌株B19鑒定為枯草芽孢桿菌。

三、結論與討論

毒死蜱作為我國有機磷農藥中廣泛使用的農藥之一，其殘留問題已引起農藥界的極大關注。李文華從蘋果園中分離到三株對毒死蜱具有高效降解能力的降解細菌HP-1、HP-2和HP-3，將其分別鑒定為人蒼白桿菌，硝基還原假單胞菌：微嗜酸寡養單胞菌。在pH7.2和28℃條件下培養7d，細菌HP-1、HP-2和HP-3對100mg·L^-1的毒死蜱降解率分別可以達到50.6%、59.5%和45.6%。張群等測定了一株從污染淤泥中分離的高效降解菌寡氧單孢菌對100mg·L^-1毒死蜱4d的降解效率約為60%。

本研究從常年施用毒死蜱農藥的農田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的高效降解菌B19，該菌株最高能夠耐受1000mg·L^-1濃度的毒死蜱，對濃度100mg·L^-1毒死蜱72h的降解率為52.34%。結合形態學、生理生化、16SrDNA序列同源性以及聚類分析，將該菌鑒定為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌作為一種極具研究開發潛力的微生物菌種，具有安全、高效、環保的特點，在環境污染處理中占據著重要地位。范迪等研究發現：添加枯草芽孢桿菌和光合細菌能夠顯著凈化水禽養殖水質，有效改善養殖環境。何芝菲從果園土壤中分離到1株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），對100mg·L^-1氯氰菊酯120h降解率為30.25%，對氯氰菊酯有明顯的降解作用。

本研究篩選出的對有機磷農藥具有高效降解能力菌株枯草芽孢桿菌B19，來源于土壤，能夠適應土壤環境，可作為有機磷農藥微生物降解的優良菌株材料進行下一步研究。

作者簡介：齊芬芳（1986-），女，湖南株洲市人，碩士，講師，研究方向：有機磷農藥微生物降解。

（責任編輯 曹雯梅）