血清PAI-1在非酒精性脂肪肝中的變化及臨床意義

姜 瀟,孫 梅

(大連市中心醫院 消化內二科,遼寧 大連116033)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是西方國家最常見的慢性肝臟疾病，在我國的發病率也逐年遞增。目前其發病機制尚不十分明確[1]。目前，肝活檢仍然是唯一區分單純脂肪變性與NASH、明確肝功能損傷及纖維化程度的方法，但由于其有創性、價格昂貴及潛在的并發癥，臨床應用受限[2]。因此，迫切需要開發可對NAFLD進行肝損傷程度的評估、明確NASH及顯著纖維化的非侵入性生物標志物。

Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是一種豐富的脂肪組織非特異性脂肪細胞因子，為絲氨酸蛋白酶抑制劑，在廣泛的生理和病理過程，包括纖溶，凝血，炎癥和傷口愈合中起關鍵作用[3]。近年來，科學家發現NAFLD患者外周血PAI-1水平較正常對照增高，來自動物研究的證據表明PAI-1在NAFLD發病中的潛在作用，減少PAI-1的產生可顯著逆轉肝脂肪變性和肝臟脂質積累[4]。因此，我們推測PAI-1外周血水平是否與NAFLD發生相關，且可否作為NAFLD可能的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

根據“非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 更新版)”，納入大連市中心醫院2019年7月至2019年12月，臨床診斷為NAFLD患者38例為實驗組,而無其他肝病(病毒性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、血色素沉著癥、威爾遜病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥，或藥物性肝病)，并排除所有降脂、降糖、降壓藥物治療的患者，同時選取性別和年齡匹配的正常對照者50例作為對照組。

1.2 ELISA法測定血漿中PAI-1水平

研究中使用的88份血樣均被收集到含EDTA的試管中，在3 000×g離心15 min分離血細胞。將血漿收集到另一個試管中，并在-80℃下保存，直到實驗使用。

檢測了血漿中的PAI-1表達水平。商業ELISA試劑盒(Lifespan Biosciences Inc.,Seattle,W A,USA)用于檢測血漿中PAI-1濃度(目錄號LS-F12251)。所有步驟均按照制造商的說明進行：(1)標準，將空白和實驗樣品(用樣品稀釋液預處理)加入96孔微孔板中，用靶向特異性捕獲抗體(抗PAI-1)預涂并在37℃下孵育1 h。(2)吸取各孔液體后，在微孔板中加入生物素結合檢測二級抗體在37℃下孵育1 h。(3)再次抽吸液體，并用洗滌緩沖液清洗每口井3次。然后，將每口井中的液體取出，用沖洗緩沖液沖洗3次后，在37℃下將每口井注入HRP共軛物30 min。(4)同樣，在至少沖洗5次后，在37℃下與四甲基聯苯胺(TMB)底物孵育10-20 min。(5)最后，用50 μl的停止溶液終止顯色反應，在450 nm波長下用微板閱讀器立即測定各孔的光密度值。用標準曲線計算每孔PAI-1濃度(ng/mL)。

1.3 血漿膽汁酸測定

采集被觀察對象晨間空腹靜脈血3 ml，分離血漿，在3 000×g離心15 min分離血細胞并收集上層血漿。應用循環酶法測定血漿膽汁酸濃度(μmol/L)。

1.4 統計學方法

統計分析采用SPSS軟件(SPSS Inc.,SPSS Standard version 18.0,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.,GraphPad Prism version 5.01,La Jolla,CA,USA)進行。基于Kolmogorov-Smirnov檢驗，符合正態分布的數據表示為平均數±標準差。采用Studentt檢驗對連續變量進行分析，采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗對分類變量進行分析，P值小于0.05代表具有統計學意義。采用單變量logistic回歸模型評估各變量與NAFLD的關系。

每位受試者均獲得書面知情同意。研究方案符合1975年赫爾辛基宣言的道德準則，并通過了大連市中心醫院倫理委員會同意。

2 結果

2.1 基線特征及血漿PAI-1表達分析

本研究共納入NAFLD患者38例(21名男性和17名女性)和對照組50例(30名男性和20名女性)的基線特征如表1所示。NAFLD患者與正常對照組相比，NAFLD組BMIs、收縮壓和PAI-1水平較高，且具有統計學意義(P<0.001)，而年齡、膽汁酸及性別，兩組比較無統計學意義(P>0.5)。

2.2 NAFLD相關因素的單因素和多因素分析

采用單因素logistic回歸分析，發現許多因素與NAFLD的存在有關。然而，根據多元logistic回歸分析，結果表明PAI-1與NAFLD的存在獨立相關，OR 值為1.190，p值小于0.001。同時研究發現BMI與NAFLD發生獨立相關，P值小于0.001。以上結果見表2。

表1 NAFLD患者與健康對照組基線特征及血漿PAI-1表達

表2 NAFLD發病相關因素的單因素和多因素分析

3 討論

NAFLD是世界上成人和兒童最常見的慢性肝病，范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎、纖維化和肝硬化[5]。NAFLD與代謝綜合征的特征密切相關，尤其是肥胖、胰島素抵抗和血脂異常，以及心血管疾病風險增加。

導致肝臟脂肪變性的確切代謝途徑仍不清楚，NAFLD和心血管疾病之間的聯系尚不十分清楚。在提出的機制中，纖溶系統與NAFLD、胰島素抵抗和動脈粥樣硬化有關聯[6]。文獻報道，PAI-1濃度升高導致血管系統血栓清除障礙并可能影響動脈粥樣硬化病變的發展[7]。同時PAI-1是由肝細胞和脂肪細胞共同產生的纖溶途徑中的一種急性期蛋白，在肥胖、血脂異常和胰島素抵抗中呈升高趨勢。

最新的動物模型研究提示PAI-1和NAFLD的發病與肝臟脂質輸出的抑制有關[8]。然而，其他研究表明，PAI-1升高與肝臟脂肪變性之間的聯系可能是由肥胖和胰島素抵抗介導的[9]。PAI-1在NAFLD發展中的作用仍需進一步研究，其亦可能成為NAFLD潛在的治療靶點。

綜上所述，PAI-1與NAFLD獨立相關。PAI-1可能成為NAFLD診斷的重要生物標志物，仍需進一步研究證實。