miR-23b-3p靶向PALM3對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響

戴彩同，張少鋒，黃玉潔

(1.廣東省惠州市第六人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)分泌科,廣東 惠州516200；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科,廣東 湛江524000)

肺泡上皮由Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞組成，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的更新能力有助于維持肺泡的完整，參與肺免疫和炎癥反應(yīng)[1]。肺炎鏈球菌是肺炎的最主要病原菌，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生炎癥，針對(duì)其凋亡和炎癥的機(jī)制探討可助于預(yù)防和治療肺炎。

研究表明，PALM3在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型中肺組織內(nèi)的表達(dá)增加，干擾PALM3 表達(dá)能減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[2]。而本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，paralemmin-3(PALM3)可能是miR-23b-3p的靶基因。miR-23b-3p對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[3]和H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs[4]起保護(hù)作用。但miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)及作用還尚未可知。

本研究通過建立A549細(xì)胞的肺炎鏈球菌模型，研究miR-23b-3p對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥和凋亡的影響，并探討PALM3在此機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

肺泡上皮細(xì)胞A549和肺炎鏈球菌株ATCC BAA-255購(gòu)自美國(guó)ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶和肝素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；引物、miR-23b-3p 模擬物(miR-23b-3p)、抑制劑(anti-miR-23b-3p)、PALM3過表達(dá)載體(pcDNA-PALM3)、PALM3抑制劑(si-PALM3)、空載體和對(duì)照物(pcDNA、miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及PALM3突變型和野生型雙熒光素酶載體購(gòu)自蘇州吉瑪基因；Total RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)、real-time PCR 試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PALM3抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；白介素-6(interleukin 6，IL-6)和白介素-10(interleukin 10，IL-10)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀和Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞和肺炎鏈球菌培養(yǎng)[5]

將A549細(xì)胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃ 5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代。

肺炎鏈球菌培養(yǎng)于含5%脫纖維羊血的血平板中，將實(shí)驗(yàn)開始前于托休二氏溶液(含0.5%酵母)中培養(yǎng)過夜。

1.2.2細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組[5]

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、感染組、轉(zhuǎn)染組和感染組+轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組：用RPMI-1640K培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；感染組：將A549培養(yǎng)至融合度達(dá)到90%左右時(shí)，然后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)A549細(xì)胞；轉(zhuǎn)染組：將不同載體或?qū)φ辙D(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h；感染組+轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞先進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h，然后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RNA提取

當(dāng)A549細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為80%時(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行進(jìn)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：miR-23b-3p過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-23b-3p；miR-23b-3p抑制組：轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-23b-3p；PALM3抑制組：轉(zhuǎn)染si-NC和si-PALM3；miR-23b-3p和PALM3雙過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染miR-23b-3p+pcDNA和miR-23b-3p+pcDNA-PALM3；PALM3野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)組：分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PALM3+miR-NC，WT-PALM3+miR-23b-3p，MUT-PALM3+miR-NC和MUT-PALM3+miR-23b-3p。將上述載體或片段轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

收集轉(zhuǎn)染過和/或肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板根據(jù) Real-time PCR試劑盒的說明書合成PALM3 mRNA和miR-23b-3p；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃40 s、59℃30 s、72℃42 s，40個(gè)循環(huán)；72℃10 min。用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率

收集各組轉(zhuǎn)染或/和感染的A549細(xì)胞并將細(xì)胞稀釋為1×105個(gè)/mL，取100 μl 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，然后根據(jù)凋亡試劑盒說明書，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)，室溫避光20 min，再加入400 μl 1×Binding buffer，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞中IL-6和IL-10的含量

收集各組A549細(xì)胞的培養(yǎng)上清，按照IL-6和IL-10試劑盒說明書操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和IL-10的含量。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)

按照1.2.3的步驟進(jìn)行A549細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的含有miR-23b-3p與PALM3預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT-PALM3)和突變型(MUT-PALM3)雙熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-NC或miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h，收集并裂解細(xì)胞，離心收集上清，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，檢測(cè)相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blot檢測(cè)PALM3和凋亡相關(guān)蛋白

收集A549細(xì)胞，裂解細(xì)胞并超聲破碎，收集蛋白，每個(gè)蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白條帶，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(PALM3抗體 1:2000，Bcl-2抗體 1∶4000，Bax抗體 1∶3000，GAPDH抗體1∶5000)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h，顯影，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白百度水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，肺炎鏈球菌感染組肺泡上皮細(xì)胞A549中miR-23b-3p含量明顯降低(P<0.05)，PALM3的mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 PALM3蛋白表達(dá)

表1 miR-23b-3p和PALM3在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，感染組A549中細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高(P<0.05)，上清液中IL-6增多且IL-10減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與感染組+miR-NC組相比，感染組+miR-23b-3p組A549細(xì)胞中miR-23b-3p含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。說明肺炎鏈球菌可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；過表達(dá)miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥。

圖2 miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響

表2 miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與感染組+miR-NC組比較，#P<0.05

2.3 干擾PALM3表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響

與感染組+si-NC組相比，感染組+si-PALM3組A549細(xì)胞中PALM3含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率降低，IL-10和Bcl-2蛋白水平升高，IL-6和Bax蛋白水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表3。說明干擾PALM3表達(dá)可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥。

圖3 干擾PALM3表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡的影響

表3 干擾PALM3表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與感染組+si-NC組比較，#P<0.05

2.4 miR-23b-3p靶向調(diào)控PALM3的表達(dá)

通過TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PALM3的3’UTR中含有與miR-23b-3p互補(bǔ)的序列，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表4所示，過表達(dá)miR-23b-3p可使野生型WT-PALM3的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)；而突變型MUT-PALM3的熒光素酶相對(duì)活性無明顯變化。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-23b-3p可下調(diào)PALM3表達(dá)量；抑制miR-23b-3p表達(dá)則上調(diào)PALM3表達(dá)量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B和表5。說明miR-23b-3p靶向負(fù)調(diào)控PALM3的表達(dá)。

圖4 miR-23b-3p靶向調(diào)控PALM3的表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表5 miR-23b-3p調(diào)控PALM3的表達(dá)

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 PALM3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的作用

為確認(rèn)miR-23b-3p是否通過PALM3影響肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥，過表達(dá)miR-23b-3p的同時(shí)過表達(dá)PALM3表達(dá)。結(jié)果表明，與結(jié)果2.2一致，過表達(dá)miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥；與感染組+miR-23b-3p+pcDNA組比較，感染組+miR-23b-3p+pcDNA-PALM3組A549細(xì)胞中PALM3表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率升高，IL-10和Bcl-2的水平降低，IL-6和Bax蛋白水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5和表6。說明過表達(dá)PALM3逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-23b-3p對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥的作用。

圖5 PALM3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用

3 討論

研究表明，Paralemmin-3(PALM3) 在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)組織中表達(dá)上調(diào)，而干擾PALM3表達(dá)可降低小鼠肺損傷死亡率，鼻內(nèi)應(yīng)用特異性siRNA抑制PALM3對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI具有保護(hù)作用[6]。ALI大鼠模型中，下調(diào)palm3可提高生存率，減輕肺組織病理改變，減輕肺水腫、肺血管滲漏和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制核因子κB和干擾素β調(diào)節(jié)因子3的活化，促進(jìn)大鼠肺泡灌洗液分泌[7]。在LPS刺激后，PALM3可以與肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)中的Toll樣受體4(TLR4)、髓細(xì)胞分化因子88、白細(xì)胞介素(IL)-1受體相關(guān)激酶-1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6、以及含有適配器分子-2的Toll-IL-1受體相互作用，促進(jìn)AMs中LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并參與了LPS-TLR4信號(hào)的傳遞[8]。以上研究結(jié)果均說明，PALM3在肺損傷中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本研究通過肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細(xì)胞A549，結(jié)果表明，感染組PALM3的mRNA和蛋白水平明顯升高，IL-6、Bax水平及細(xì)胞凋亡率明顯升高，IL-10、Bcl-2含量明顯降低，干擾PALM3表達(dá)可抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥，與上述結(jié)果一致[6,7]，PALM3參與肺炎的發(fā)生。

表6 PALM3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-23b-3p過表達(dá)對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的作用

注：與感染組+miR-NC組比較，*P<0.05；與感染組+miR-23b-3p+pcDNA組比較，#P<0.05

此外，本研究通過TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PALM3的3’UTR中含有與miR-23b-3p互補(bǔ)的位點(diǎn)，提示PALM3可能是miR-23b-3p的靶基因，miR-23b-3p可能靶向PALM3參與對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549凋亡和炎癥的調(diào)控過程。研究表明，miR-23b-3p在肝癌[9]、食管鱗狀細(xì)胞癌[10]和胃癌[11]中表達(dá)異常，與癌癥的惡性進(jìn)展、癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移或化療抗藥性有關(guān)。miR-23b-3p在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)顯著增加，與患者總體低生存率相關(guān)[12,13]。miR-23b-3p在肺炎中的研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549中水平顯著降低，過表達(dá)miR-23b-3p表達(dá)可減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥并抑制細(xì)胞凋亡，說明miR-23b-3p在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p靶向負(fù)調(diào)控PALM3的表達(dá)；過表達(dá)PALM3逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-23b-3p對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和炎癥的作用，驗(yàn)證了在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549中miR-23b-3p靶向調(diào)控PALM3發(fā)揮作用。

綜上所述，在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549中，miR-23b-3p表達(dá)下調(diào)，PALM3表達(dá)上調(diào)，肺炎鏈球菌可能通過下調(diào)miR-23b-3p靶向PALM3誘導(dǎo)A549細(xì)胞的炎癥發(fā)生和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-23b-3p和PALM3可能是肺炎鏈球菌所致肺炎的潛在靶點(diǎn)。