以葉酸為靶向分子擔(dān)載紫杉醇納米顆粒對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

趙 航，趙啟明，王 蒙

(長春市中心醫(yī)院 普外科，吉林 長春130051)

目前手術(shù)切除、肝移植、介入、射頻消融等方法為肝臟腫瘤治療常用手段，化學(xué)藥物治療(如阿霉素、鉑類藥物等)亦是最主要的有效手段之一。但是，由于化療藥物本身或者藥物溶媒顯著的毒副作用，以及腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，化療很難達(dá)到理想效果。紫杉醇(Paclitaxol，商品名 Taxol，略作 PTX)是用于治療肝癌的一線化療藥物，但是由于其水溶性差，臨床用市售紫杉醇注射液多以聚氧乙烯蓖麻油/無水乙醇(體積比 1∶1)混合液作為溶劑。無論是紫杉醇本身還是溶劑都能引起嚴(yán)重過敏、溶血、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，限制了藥物發(fā)揮療效。臨床化療迫切要求提高紫杉醇藥物的生物利用率，減少其對機(jī)體的毒副作用[1-3]。本研究設(shè)計并制備以葉酸為靶向分子擔(dān)載紫杉醇納米顆粒，使藥物特異性地被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，實(shí)現(xiàn)鍵合抗肝腫瘤藥物靶向控制釋放，提高藥物療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

空聚合物載體(PEG-b-PLA，簡稱為M)、紫杉醇(PTX)、高分子鍵合紫杉醇膠束(M(PTX))及葉酸靶向紫杉醇膠束(FA-M(PTX))均由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco)，CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；YXQ-LS-18SI高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)、DMI3000B倒置熒光顯微鏡(Leica公司)。

1.2 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個/mL，接種于96孔板。各孔分別加入100 μl細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)18-20 h。待細(xì)胞貼壁，小心吸棄培養(yǎng)基，加入200 μl含有濃度分別為 100、10、1.0、0.1、0.01 μg/mL的空聚合物載體(PEG-b-PLA，簡稱為M)培養(yǎng)基溶液，或PTX質(zhì)量濃度為10、1、0.1、0.01 μg/mL的紫杉醇(PTX)、高分子鍵合紫杉醇膠束(M(PTX))和葉酸靶向紫杉醇膠束(FA-M(PTX))的培養(yǎng)基溶液，以僅加入200 μl培養(yǎng)基為陰性對照組。

1.3.2CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將上述各組每一個處理孔設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5% CO2孵箱中分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h后取出各板。小心吸棄培養(yǎng)基，每孔再加入新鮮的含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀在450 nm處測得吸光度(OD值)，并計算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%) = (1-實(shí)驗組OD值/對照組OD值) ×100%。

1.3.3Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，1000 rpm離心5 min，小心吸棄培養(yǎng)基，分別加入含PTX質(zhì)量濃度為10 μg/mL的PTX、M(PTX)、FA-M(PTX)的培養(yǎng)基 2 ml，培養(yǎng) 72 h。以加入單純培養(yǎng)基的孔為空白對照孔，每組設(shè)3個復(fù)孔。72 h后在每組細(xì)胞懸浮液中加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液，重懸細(xì)胞后，再加入5 μl Annexin V-FITC染液和10 μl PI染液，小心混勻。避光室溫反應(yīng)10 min，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。用未染色的肝癌細(xì)胞懸液調(diào)零，以Annexin V-FITC單染管及PI單染管作為基準(zhǔn)參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析處理采用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件，多組比較采用單因素ANOVA方差分析。P<0.05視為差別顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高分子鍵合膠束對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響

見圖1。倒置顯微鏡下于72 h觀察對照組及經(jīng)含有不同濃度的高分子鍵合膠束作用的肝癌細(xì)胞。結(jié)果表明，F(xiàn)A-M本身對細(xì)胞的生長無影響，故不影響后續(xù)紫杉醇膠束的作用效果評價。而PTX、M(PTX)和FA- M(PTX)組肝癌細(xì)胞數(shù)量有所減少。

2.2 高分子鍵合膠束對肝癌細(xì)胞活性的影響

體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度的聚合物膠束M和FA-M分別作用 24 h、48 h、72 h后，經(jīng)CCK-8法檢測，發(fā)現(xiàn)作用濃度為1.0 μg/mL時抑制率最大(2.63%)。而高濃度和低濃度的聚合物膠束M和FA-M對細(xì)胞的抑制率基本一致，無明顯差異。顯示出空膠束載體PEG-b-PLA和導(dǎo)向物葉酸并無明顯時間或劑量依賴的增殖抑制作用，見表1。

在作用24 h時，10 μg/mL高濃度的PTX、M(PTX)和FA- M(PTX)膠束對肝癌細(xì)胞的抑制作用沒有顯著性差異；藥物濃度稀釋10倍后，F(xiàn)A- M(PTX)膠束對肝癌細(xì)胞的抑制作用顯著低于PTX(P<0.05)；進(jìn)一步稀釋達(dá)到0.1 μg/mL時，M(PTX)和FA- M(PTX)膠束對肝癌細(xì)胞的抑制作用均顯著低于PTX(P<0.05)；藥物濃度低于0.001 μg/mL時，對癌細(xì)胞的抑制率作用微弱。在作用48 h時，10 μg/mL高濃度的M(PTX)膠束對肝癌細(xì)胞的抑制作用顯著低于同濃度的PTX(P<0.05)。當(dāng)藥物濃度稀釋10倍至1 μg/mL及以下濃度時，M(PTX)和FA-M(PTX)膠束對肝癌細(xì)胞的抑制作用均顯著低于PTX(P<0.05)；當(dāng)藥物濃度低于0.1 μg/mL及以下時，M(PTX)膠束對癌細(xì)胞的抑制率也顯著低于FA-M(PTX)膠束(P<0.05)。當(dāng)藥物繼續(xù)作用癌細(xì)胞達(dá)72 h時，對癌細(xì)胞的抑制程度與48 h時相似。結(jié)果表明，這3種藥物對肝癌細(xì)胞均有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，對細(xì)胞生長的抑制率明顯增強(qiáng)，見表2。

圖1 高分子鍵合膠束對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響

表1 聚合物膠束 PEG-b-PLA 對肝癌細(xì)胞的抑制作用

表2 高分子鍵合膠束對肝癌細(xì)胞活性的影響

▲P<0.05,compare with PTX group of the same condition;★P<0.05,compare with M(PTX) group of the same condition

2.3 高分子鍵合膠束對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染檢測觀察，藥物含 PTX質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，作用72 h抑制率較穩(wěn)定，故選擇該濃度及時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。如圖2所示，PTX、M(PTX)和FA-M(PTX)3種藥物(PTX質(zhì)量濃度皆為10 μg/mL)處理72 h的細(xì)胞凋亡率與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

肝臟是人體合成,代謝、分解大量物質(zhì)的重要器官。我們國家病毒性肝炎肝硬化后肝癌的發(fā)病率特別高，所以能夠精準(zhǔn)的作用于腫瘤細(xì)胞并且又能很好的保護(hù)正常的肝臟細(xì)胞的藥物的靶向問題是肝臟疾病研究的首要課題。

本實(shí)驗證明應(yīng)用無毒而又安全的高分子材料作為載體，能夠提升肝臟腫瘤治療效果實(shí)現(xiàn)癌變組織的靶向和控制釋放。FA-M(PTX)在腫瘤組織周圍聚集，提高藥物的能效以葉酸為靶向分子擔(dān)載抗癌藥紫杉醇納米顆粒可以實(shí)現(xiàn)肝臟腫瘤的靶向控制釋放，使藥物被腫瘤細(xì)胞特異性吞噬，提高藥物的作用效果。比較鍵合藥物和靶向分子理化特性對肝癌組織靶向釋放效果與生物學(xué)活性來研究藥物輸送的關(guān)鍵因素，達(dá)到鍵合抗腫瘤藥物腫瘤組織的靶向控制釋放[1-4]。這種高分子載藥納米粒子具有EPR效應(yīng)，可以被動靶向給藥同時又具有主動腫瘤靶向性。

圖2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測肝癌細(xì)胞的凋亡

但抗腫瘤高分子納米藥物在應(yīng)用及進(jìn)一步研究中還存在許多問題，比如在藥物代謝動力學(xué)方面研究深度不夠；對于影響癌細(xì)胞靶向機(jī)理的關(guān)鍵因素還缺少更加系統(tǒng)性的研究。雖然在高分子納米抗腫瘤藥物在一定程度上具有靶向性，但效果并不夠顯著[5-7]。靶向腫瘤的藥物輸送是機(jī)體十分復(fù)雜的過程，納米載體要克服生物屏障才能夠?qū)崿F(xiàn)成功的輸送；要實(shí)現(xiàn)高效富集于癌細(xì)胞中需要在血液系統(tǒng)中存留較長時間，快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并到達(dá)腫瘤細(xì)胞藥物快速釋放都是我們繼續(xù)研究的方向[7，8]。最終提高治愈率降低化療藥物的副作用，延長癌癥患者的生命。