喜炎平與頭孢唑林鈉聯用對感染小鼠中性粒細胞凋亡的影響

熊南燕，劉曉霞*，陳劍華，李衛霞，郭旭麗，王雪玲，霍忠超

(1.河北工程大學醫學院，河北 邯鄲 056038;2.河北工程大學附屬醫院)

抗生素自問世以來在感染性疾病的治療方面發揮了很重要的作用，但隨著抗生素的使用，耐藥菌株逐漸增多，抗生素的療效逐漸降低。為了改善此現狀，臨床上常將一些具有清熱解毒作用的中藥制劑與抗生素聯合應用治療感染性疾病，喜炎平即為常用中藥制劑之一。臨床上已將喜炎平注射液與阿奇霉素[1]、左氧氟沙星[2]、克林霉素[3]、頭孢哌酮[4]、頭孢曲松[5]等抗生素聯合治療呼吸道感染、扁桃體炎、化膿性中耳炎等感染性疾病，發現其效果顯著，能提高臨床有效率。本研究將喜炎平注射液與頭孢唑林鈉聯合應用于金葡球菌感染小鼠，探討其對中性粒細胞凋亡的影響及機制，為中藥制劑與抗生素聯合應用提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 菌株金葡菌敏感菌株(26001-25)、金葡菌標準菌株(ATCC25923)購自北京藥品生物制品檢定所。

1.2 藥品與試劑頭孢唑林鈉(中諾藥業，國藥準字H13020765，1 g/支)，喜炎平注射液(江西青峰，國藥準字Z20026249，規格2 mL∶50 mg)；小鼠中性粒細胞分離液(天津灝洋)、紅細胞裂解液(天津灝洋)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天)； 小鼠IL-6、IL-10檢測試劑盒(南京森貝伽)；小鼠sFas 檢測試劑盒(泉州睿信生物)。

1.3 動物造模及分組昆明小鼠70只，體重17-23 g，雌雄各半。于造模前1天，間隔1 h，經小鼠直腸測體溫2次，選擇體溫(36.5±0.2)℃，兩次體溫相差不超過0.2℃的小鼠65只。于造模當天每只入選小鼠腹腔注射金葡菌(9×108/mL)0.2 ml， 1 h后，經直腸測量體溫，選擇體溫高于37.2℃的小鼠60只，根據體溫編號，并隨機分為模型組、頭孢唑林鈉組、喜炎平組及頭孢唑林鈉+喜炎平組，每組15只；另選15只體溫正常小鼠，腹腔注射PBS，作為對照組。于造模當日，各組小鼠均經腹腔按體重給藥，每日2次，對照組和模型組給予生理鹽水(70 mg/kg)；頭孢唑林鈉組給予頭孢唑林鈉(70 mg/kg)；喜炎平組給予喜炎平注射液(13 mg/kg)；頭孢唑林鈉+喜炎平組給予頭孢唑林鈉(70 mg/kg)和喜炎平注射液(13 mg/kg)；共給藥7天。

1.4 小鼠中性粒細胞和血漿分離分別于給藥第1、4、7天，經心臟采血約1.5 ml，抗凝，每次5只小鼠。0.5 ml抗凝血用于分離中性粒細胞，操作步驟嚴格按說明書進行，取中性粒細胞層，裂解紅細胞，洗滌，臺盼藍檢測細胞活力(>95%)。余抗凝血離心分離血漿備用。

1.5 中性粒細胞凋亡檢測取2×105/mL中性粒細胞用冰PBS洗滌2次，棄上清，加入Annexin V-FITC結合液195 μl，重懸細胞，加入Annexin V-FITC 5 μl，混勻，加入PI 10 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，孵育過程中重懸細胞2次，流式細胞儀檢測。

1.6 血漿IL-6、IL-10和sFas檢測取1.4中制備的血漿，采用ELISA法檢測血漿IL-6、IL-10和sFas含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組中性粒細胞凋亡率比較由流式細胞儀檢測結果可知，用藥第1天，各組間中性粒細胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)；用藥第4天和第7天，與對照組相比，模型組凋亡率顯著降低(P<0.05)，頭孢唑林鈉組無顯著變化(P>0.05)，喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組顯著升高(P均<0.05)；與模型組相比，頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組凋亡率顯著升高(P均<0.05)，且喜炎平組凋亡率顯著高于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯合用藥組的凋亡率顯著高于各自單用藥組(P均<0.05，表1、圖1)。

2.2 各組血漿IL-6水平比較ELISA結果顯示，用藥第1天，與對照組相比，其他4組血漿IL-6水平顯著升高(P均<0.05)，而該4組之間無顯著性差異(P>0.05)。用藥第4天，與對照組相比，其他4組IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，與模型組相比，其他3組IL-6水平顯著降低(P均<0.05)，且喜炎平組顯著低于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯合用藥組顯著低于各自單用藥組(P均<0.05)。用藥第7天，模型組、頭孢唑林鈉組和喜炎平組IL-6水平與對照組相比均顯著升高(P均<0.05)，但頭孢唑林鈉+喜炎平組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，其他3組IL-6水平顯著降低(P均<0.05)，且喜炎平組顯著低于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯合用藥組顯著低于各自單用藥組(P均<0.05)。模型組隨著感染時間的延長，第4天和第7天IL-6水平均顯著降低(P均<0.05)；其他3個用藥組，也隨著用藥時間的延長，第4天和第7天IL-6水平顯著降低(P均<0.05，表2)。

表1 各組中性粒細胞凋亡率比較(%)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05

注：A：對照組；B：模型組；C：頭孢唑林鈉組；D：喜炎平組；E：頭孢唑林鈉+喜炎平組

表2 各組血清IL-6水平比較(ng/L)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05。與第1天相比，aP<0.05；與第4天相比，bP<0.05

2.3 各組血漿IL-10水平比較用藥第1天，與對照組相比，其他4組血漿IL-10水平顯著升高(P均<0.05)，但該4組之間無顯著性差異(P>0.05)。用藥第4天和第7天，與對照組相比，其他4組IL-10水平均顯著升高(P均<0.05)，與模型組相比，其他3組IL-10水平顯著升高(P均<0.05)，且喜炎平組顯著高于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯合用藥組顯著高于各自單用藥組(P均<0.05)。模型組隨著感染時間的延長，第4天和第7天IL-10水平均顯著降低(P均<0.05)；而頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組，用藥第4天和第7天IL-10水平顯著高于第1天，但各組在該兩個時間點之間無顯著性差異(P>0.05，表3)。

表3 各組血清IL-10水平比較(ng/L)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05。與第1天相比，aP<0.05

2.4 各組血漿sFas水平比較用藥第1天、第4天和第7天，模型組、頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組血漿sFas水平顯著高于對照組；但該4組在同一時間點，彼此之間無顯著性差異(P均>0.05)，且該4組中，各組不同時間點之間亦無顯著性差異(P均>0.05，表4)。

表4 各組血漿sFas水平比較(μg/L)

注：與對照組相比，*P<0.05

3 討論

中性粒細胞(neutrophils)是機體非特異性抗感染免疫的第一道防線[6]，其主要存在于血液中，不僅能吞噬清除血液中的細菌，還可在趨化因子的作用下，通過趨化運動從血液進入到組織對細菌進行吞噬，并通過胞內殺菌機制和脫顆粒達到清除細菌的目的。此為非特異性過程，中性粒細胞在消滅細菌的同時，也會對自身組織造成損傷[6]，及時清除中性粒細胞是炎癥減弱的關鍵。凋亡是中性粒細胞安全清除的有效方式，其凋亡后可被巨噬細胞完整吞噬[7]，不再釋放酶性物質，減少對機體的損傷，故其凋亡在炎癥的發展和轉歸中發揮關鍵作用。鑒于目前臨床上常將中藥制劑與抗生素聯合用于感染性疾病的治療，為了尋找聯合用藥的機制，本研究觀察了喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用對中性粒細胞凋亡的影響。結果發現，感染后小鼠中性粒細胞凋亡率降低，提示出現凋亡延遲現象。楊帆[8]進行體外研究認為金葡菌可促進奶牛中性粒細胞凋亡，與本研究結果不相符，可能與本研究為體內實驗，受復雜內環境的影響有關。本研究結果還顯示，頭孢唑林鈉單用可促進中性粒細胞凋亡，但仍低于正常水平，而喜炎平單用、喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用可使其凋亡率大大提高，甚至高于正常水平，聯合用藥提高更顯著。李洪濤等[9]發現北五味子多糖可促進健康人中性粒細胞凋亡，賴曉敏[10]發現加味四君子湯可促進嚴重燙傷大鼠中性粒細胞凋亡；與本研究結果一致，提示中藥相關藥物能夠促進中性粒細胞凋亡。

中性粒細胞凋亡過程受多種因素調節[11]，其中細胞因子就是影響因素之一，因其種類繁多，對中性粒細胞凋亡既可抑制，也可促進。IL-6和IL-10分別是體內有效的內源性促炎因子和抗炎因子，韓露等[12]發現IL-6可延遲中性粒細胞凋亡，發揮抑制作用；Hofman[13]認為IL-10能加速LPS激活的中性粒細胞凋亡。本研究將IL-6和IL-10作為觀察對象，發現小鼠感染后，血漿IL-6和IL-10水平均升高，但隨感染時間延長，其水平逐漸降低，楊明等[14]認為金葡菌經血流感染小鼠，血清IL-6和IL-10水平分別在感染后12 h和3 h達高峰，之后逐漸降低，這一變化趨勢與本研究一致。頭孢唑林鈉、喜炎平及二者聯合用藥均可顯著降低IL-6水平，且在給藥期限內，用藥時間越長，降低程度越大；頭孢唑林鈉與喜炎平聯合用藥降低效果更顯著，用藥結束基本達到正常水平。而對于IL-10，各用藥組均能顯著提高其水平，但單用頭孢唑林鈉提高IL-10水平能力較單用喜炎平組和二者聯用效果略差，二者聯合用藥提高IL-10的能力最顯著；各用藥組在用藥第4天血漿IL-10水平高于用藥第1天，用藥第7天與第4天無差異，提示各種用藥方式對血漿IL-10水平的提高作用受用藥時間影響不明顯。提示喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用可能通過降低IL-6水平、提高IL-10水平來促進中性粒細胞凋亡。李洪濤[9]認為北五味子多糖可以通過降低IL-6表達促進中性粒細胞凋亡，Yang[15]研究發現特定抑制劑對SHP-2抑制后可通過提高IL-10水平促進中性粒細胞凋亡，與本研究結果相符。

此外，中性粒細胞還可通過Fas/FasL信號途徑介導凋亡，血漿中分泌型Fas(sFas)對該途徑有競爭抑制作用，從而也抑制中性粒細胞凋亡[11]。本研究發現，金葡菌感染后小鼠血漿sFas水平顯著升高，隨感染時間的延長，其水平有增高趨勢，但無顯著性差異，提示sFas可能參與了中性粒細胞凋亡延遲。Huttunend等[16]也發現菌血癥時，血清sFas水平升高；酈珊珊[17]的研究結果顯示血漿sFas水平越高，中性粒細胞凋亡率越低。但關于治療措施對sFas的影響還未見報道。本研究顯示頭孢唑林鈉、喜炎平及喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用對血漿sFas水平無顯著影響。

綜上所述，喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用能促進金葡菌感染小鼠的血漿中性粒細胞凋亡，能降低血漿IL-6水平、提高IL-10水平，對血漿sFas水平無顯著影響。故認為喜炎平與頭孢唑林鈉聯合應用可能通過調節IL-6和IL-10水平，來促進中性粒細胞凋亡，從而減輕炎癥反應，改善患者癥狀，這可能是二者聯合用藥治愈疾病的機制之一。