結膜成纖維細胞由來的警報素對角膜成纖維細胞的促炎作用

陳 琳，劉蘋蘋，楊秀霞，李 勤，劉 洋

(中山大學附屬第五醫院 眼科，廣東 珠海519000)

眼部燒傷，是常見的嚴重眼部急癥，占眼外傷的8-18%[1]。嚴重的眼燒傷，即使及時治療，預后仍較差，常導致角膜上皮愈合不良，基質出現持續性角膜潰瘍，角膜穿孔甚至失明[2]。持續的角膜基質炎癥反應及炎性細胞的浸潤，在嚴重角膜燒傷所導致的角膜基質溶解的發生發展過程中起著重要的作用[3]。損傷細胞在非感染性應激或損傷反應時會釋放一類內源性的物質到細胞外環境中，可以與模式識別受體相結合啟動機體的過度炎癥反應，這一類內源性分子被稱為損傷相關分子模式(DAMPs)也稱為警報素(alarmins)[4]。Alarmins可以向周圍的組織發送信號，將炎癥細胞募集到受損的組織，并觸發無菌性炎癥反應[5]。為了改善眼燒傷的預后，目前國內外提出了各種內外科的治療方法：類固醇、四環素或抗壞血酸；腱成形術；羊膜修補術等[6,7]。然而，這些療法在治療持續性角膜基質溶解方面的療效仍不令人滿意，尋找有效治療角膜基質溶解的措施并闡明其機制是目前眼科學面臨的重要課題之一。在本研究中，我們探討結膜成纖維細胞壞死上清產生的警報素(alarmins)對人角膜基質成纖維細胞(HCFs)釋放促炎因子及粘附分子的影響及可能機制，為眼部燒傷時抑制角膜基質炎癥反應及潰瘍形成的藥物研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人結膜成纖維細胞和人角膜基質細胞(HCFs)購于美國ScienCell；MEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購于美國Sigma-Aldrich；PBS緩沖液購于廣州晶欣公司；IκB-α、磷酸化-IκB-α購于美國Cell Signaling Technology；NF-κB 內源性抑制劑 (IκB 激酶 (IKK)-2 抑制劑)購于美國Merck Millipore；NF-κB p65購于美國Santa cruz；4′,6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)購于美國MP Biomedicals ；山羊抗鼠IgG(H+L)488熒光抗體購于美國Invitrogen；人IL-6 ELISA 試劑盒、人 IL-8 ELISA試劑盒、人 MCP-1 ELISA 試劑盒購于中國博士德公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人結膜成纖維細胞和人角膜基質細胞成纖維細胞在10% FBS+雙抗的MEM培養基及37℃，5% CO2培養箱中進行培養。使用胰蛋白酶EDTA處理分離細胞。第4-6代細胞用于隨后的實驗。

1.2.2結膜成纖維細胞壞死上清的制備 通過反復凍融處理獲得人結膜成纖維細胞的壞死上清液[8]。將培養瓶中的人結膜成纖維細胞用PBS洗滌兩次，然后用37℃的胰蛋白酶EDTA處理分離，并收集在10%FBS-MEM中。用無血清的MEM洗滌兩次后，細胞以1×106cell/mL的濃度在無血清MEM中重懸。細胞在-196℃下的液氮中進行三輪快速冷凍3 min，然后在37℃水浴中再解凍3 min。細胞裂解物在15 000 rpm、4℃離心10 min后收集，獲得壞死的人結膜成纖維細胞上清液(NHCS)。

1.2.3ELISA檢測IL-6、IL-8、MCP-1分泌 按BOSTER ELISA試劑盒提供步驟進行實驗，收集處理后的細胞上清液，并進行細胞計數。樣品10倍稀釋，每孔均加入100 μl稀釋好的樣品及標準品，37℃ 90 min，不洗。加入生物素標記抗體工作液，37℃ 60 min，洗3次。加入親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液，37℃ 30 min，洗5次。加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液， 37℃避光20 min。反應完成后，加TMB終止液，此時反應液呈黃色。用酶標儀測定OD值(450 nm)，讀數。繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.2.4Western blot檢測IκB、p-IκB、ICAM-1表達 收集處理后的細胞，每孔細胞培養皿加入100 μl裂解液(PMSF：RIPA的濃度比為1∶100)。BSA法進行蛋白濃度的測定。取10 μg樣品上樣，電泳90V，待條帶進入分離膠時，改設置電壓120 V，轉膜恒流350 mA，90 min，常溫封閉1 h，后根據目的蛋白加入相應的一抗滴度均為1∶1 000，4℃搖床過夜。二抗滴度均為1∶3 000，常溫1 h。β-actin抗體用作內參用來判斷各組間的上樣量是否一致。

1.2.5免疫熒光染色檢測NF-κB p65 將生長狀態良好的HCF細胞接種于60 mm培養皿中，每皿放入3片細胞爬片。在無血清MEM培養基中孵育24 h后，加入3×105cell/mL NHCS或不加入NHCS，處理0 min或30 min后進行細胞免疫熒光染色。3%BSA封閉1 h后，加入一抗p65(滴度1∶50)常溫2 h，熒光二抗(滴度1∶500)常溫1 h，避光。DAPI染核，15 min，避光，后進行封片。

1.3 統計學分析數據采用SPSS19.0進行單因素方差分析，數值用均數±標準差P<0.05代表有統計學意義。

2 結果

2.1 NHCS對HCFs產生炎性介質的影響

無血清孵育后的HCFs在不同濃度的NHCS(0、0.1、0.3、1或3×105cell/mL)中處理相同時間(24 h)。免疫印跡檢測顯示，與未經NHCS處理組相比，NHCS明顯促進HCFs分泌炎性因子IL-6(圖1A)、趨化因子IL-8(圖1B)、MCP-1(圖1C)及表達粘附分子ICAM-1(圖1G)，且呈濃度依賴性增加；同時，我們結果也發現，無血清孵育后的HCFs在相同濃度的NHCS(3×105cell/mL)作用不同時間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)后， IL-6(圖1D)、IL-8(圖1E)、MCP-1(圖1F)和ICAM-1(圖1H)的表達也明顯增加，呈時間依賴性。這些結果表明NHCS可誘導HCFs產生炎性因子IL-6、趨化因子IL-8、 MCP-1和粘附分子ICAM-1來介導HCFs炎癥反應。

圖1 NHCS對HCFs釋放炎性因子、趨化因子及粘附分子的影響

2.2 NHCS對NF-κB信號轉導的影響

NF-κB信號通路在眼部炎癥中起著重要作用。為了研究NHCS對HCFs中NF-κB信號可能的影響，我們用3×105cell/mL NHCS對HCFs進行了不同時間的處理。免疫印跡分析表明， NHCS以一種時間依賴的方式激活參與NF-κB信號通路途徑的IκB-α(圖2A)。免疫熒光染色顯示， NF-κB p65亞基(綠色熒光)在NHCS處理30 min后進入細胞核。(圖2B)注：標尺為20 μM。以上結果表明，NHCS可通過誘導IκB-α磷酸化和介導NF-κB p65亞基入核參與NF-κB信號通路。

圖2 NHCS對NF-κB信號轉導的影響

2.3 IKK-2抑制劑對NHCS誘導HCFs產生炎性介質的影響

為了確定NF-kB信號通路在HCFs產生炎性介質過程中的作用，用不同濃度的NF-kB信號通路抑制劑IKK-2抑制劑(0、0.3、1、3、10 μM)孵育2 h，然后用3×105cell/mL NHCS+IKK2抑制劑孵育24 h。ELISA檢測顯示，添加IKK-2抑制劑的組能明顯抑制NHCS所誘導的IL-6(圖3A)、IL-8(圖3B)和MCP-1(圖3C)的表達，且呈濃度依賴性減少。同時，免疫印跡分析表明，用IKK-2抑制劑能夠顯著抑制NHCS誘導的粘附分子ICAM-1的表達(圖3D)。以上表明，IKK-2抑制劑可抑制NHCS所誘導的HCFs炎癥反應。

圖3 IKK-2抑制劑對炎性介質表達的影響

2.4 IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)和TNF-α受體拮抗劑(R7050)對NHCS誘導HCFs產生炎性介質的影響

為了研究NHCS中的alarmins，我們首先將3×105cell/mL NHCS與IL-1RA(300 ng/mL)或R7050(1 000 ng/mL)處理2 h，然后再置于培養基中孵育HCFs,即孵育HCFs 24 h。ELISA檢測顯示，單獨使用NHCS處理組與未使用對照相比IL-6、IL-8、MGP-1、ICAM-1表達明顯增加，添加IL-1RA能明顯抑制NHCS所誘導的IL-6(圖4A)、IL-8(圖4B)、MCP-1(圖4C)、ICAM-1(圖4G)的表達；同樣，添加R7050能明顯抑制NHCS所誘導的IL-6(圖4D)、IL-8(圖4E)、MGP-1(圖4F)、ICAM-1(圖4G)的表達。

3 討論

在本實驗中，我們發現NHCS通過激活NF-κB信號通路，并以濃度及時間依賴方式刺激HCFs表達ICAM-1、IL-6、IL-8和MCP-1。阻斷NF-κB信號通路可以抑制上述炎性因子、趨化因子和粘附分子的產生。另外，我們的研究結果顯示 IL-1或TNF-α受體拮抗劑可明顯抑制HCFs表達上述炎性介質。

角膜發生炎癥時，角膜基質細胞被激活成角膜成纖維細胞，通過調節炎性因子，如細胞因子、趨化因子和粘附分子等在局部免疫和炎癥反應中發揮重要作用[9]。IL-6可以促進B細胞的增殖、分化及分泌，IL-8具有強趨化中性粒細胞到角膜組織的作用，并能使之激活，MCP-1則對單核細胞和嗜堿性粒細胞有趨化作用[9]。ICAM-1可通過調節細胞間粘附作用促進炎性細胞的局部浸潤[10]。浸潤的炎性細胞及活化的角膜基質細胞可分泌膠原酶，導致角膜基質膠原過度降解，形成角膜潰瘍[11]。在堿燒傷的大鼠模型中，可以檢測到IL-6、MCP-1和ICAM-1 mRNA的上調[12]。IL-6受體阻滯劑在角膜堿燒傷的抗炎作用中也起到了有效的作用[13]。我們的實驗結果顯示NHCS可以誘導HCFs產生粘附分子ICAM-1、炎癥因子IL-6、趨化因子IL-8和MCP-1，表明NHCS可能通過誘導HCFs釋放炎性介質促進角膜基質無菌性炎癥反應的發生發展。

圖4 IL-1RA和R7050對NHCS誘導HCFs產生炎性介質的影響

角膜潰瘍的特征是角膜基質的過度降解。研究顯示許多信號通路，如NF-κB介導的通路，參與角膜潰瘍的發生[14]。NF-κB信號轉導通路屬于受蛋白水解酶調控的信號轉導通路，核轉錄因子NF-κB在非活性狀態下與其抑制蛋白(IκB)結合，IκB掩蓋了NF-κB的核定位信號(NLS)，使NF-κB滯留在細胞質。上游的刺激信號使IκB在IKK(IκB kinase)的作用下發生磷酸化，繼而被泛素酶體系識別降解， NF-κB從而被釋放，暴露NLS，使NF-κB進入細胞核與靶基因結合，調節基因表達[15]。各種病理因素激活的NF-κB信號轉導是由IκB的磷酸化和降解所觸發的[16]。我們的實驗結果顯示，NHCS可促進IκB磷酸化，并介導p65亞基進入細胞核。此外，阻斷NF-κB信號通路也可以抑制上述粘附分子ICAM-1、炎癥因子IL-6、趨化因子IL-8和MCP-1的產生。這些結果表明，NF-κB信號通路參與了NHCS誘導的非特異性炎癥反應。

損傷相關分子模式(DAMPs)即警報素(alarmins)是一類組織細胞損傷而產生的內源性模式分子，損傷細胞釋放的alarmins主要包括高遷移率基團盒(HMGB)-1、S100蛋白、IL-1α、IL-33、熱休克蛋白、鈣網蛋白和纖維蛋白原降解產物[17]。這些分子可以觸發非感染性炎癥，促進傷口愈合和恢復組織穩態[18]。白細胞介素是一種重要的信使分子，具有調節細胞行為和啟動炎癥反應的能力[19]。IL-1細胞因子是一種典型的DAMP，介導多種炎癥反應[20]。在非感染性骨關節炎中，IL-1α涉及軟骨基質的破壞與修復，參與基質降解性蛋白的合成，IL-1β刺激骨關節滑膜成纖維細胞的增殖與粘附分子的表達，促進炎性細胞的浸潤[21]。IL-1主要通過其受體發揮生物學效應[22]。其中IL-1激活NF-κB還需要IKK2的激活。TRAF6作為一個E3泛素連接酶，可將IRAK1和接頭蛋白TAB2和TAB3連接到IL-1信號通路的中間分子上。IKK1、IKK2與調節亞基NEMO共同構成IKK核心復合體，其中NEMO結合到上游分子IRAK1和結合TAB2(TGF-β-activated protein kinase-binding protein 2)或TAB3的TAK1(TGF-β-activated protein kinase)的泛素鏈上，促使IκB發生泛素化降解，NF-κB被激活[23]。IL-1受體拮抗劑(IL-1RA)是一種通過與IL-1受體結合而減弱IL-1生物活性的抑制劑[17,24]。TNF-α是一種已知參與角膜炎癥的炎癥細胞因子，以三聚體的形式與細胞表面受體TNF-R結合發揮作用。在一項小鼠堿燒傷模型中進行的研究表明，TNF-α在24小時內明顯上調，最終導致角膜穿孔和/或瘢痕形成[25]。在動物模型和臨床研究中，抗TNF-α抗體已被證明對保護角膜不融化和促進傷口愈合有效[26]。我們實驗結果表明， IL-1RA和R7050可抑制NHCS所誘導HCFs釋放炎性介質，提示由結膜成纖維細胞壞死上清產生的警報素包括IL-1和TNF-α，通過促進HCFs表達各種炎性介質而介導角膜基質的無菌性炎癥反應，從而進一步促進角膜基質潰瘍的形成。

綜上所述，壞死的結膜成纖維細胞釋放的IL-1和TNF-α通過NF-κB信號通路可促進角膜基質成纖維細胞分泌炎性介質從而引起角膜炎癥反應。IL-1和TNF-α可能成為治療嚴重眼燒傷患者角膜基質降解的潛在治療靶點，也為后期進一步進行的詳盡機制研究奠定了理論基礎。