染色體脆性位點以及全新普通型脆性位點基因FATS的研究進展

張 軍,鄭向前,高 明*

(1.天津醫科大學腫瘤醫院 乳腺二科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060;2.天津醫科大學腫瘤醫院 甲狀腺頸部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060)

腫瘤學研究包括發現新的抑癌基因并探討抑癌基因在腫瘤發生發展過程中的作用機制。染色體脆性位點(fragile site)是正常基因組中位點特異的不穩定區域，包括稀有型脆性位點(rare fragile site)和普通型脆性位點(common fragile site,CFS)，稀有型脆性位點與腫瘤的關系并不明確，然而普通型脆性位點與多種腫瘤基因組變異位點相一致，它們與腫瘤的發生發展密切相關。但是由于缺少鑒定CFS的方法，其生物學功能以及作用機制仍不清楚。進化上保守的CFS與腫瘤發生密切相關，發現并闡明CFS基因生理功能以及調控機制，對于推動癌癥病因學，腫瘤發生發展的研究，以及腫瘤分子診斷和風險預測具有重要意義，本文對染色體脆性位點以及全新普通型脆性位點基因 FATS(fragile-site associated tumor suppressor)的研究進展進行綜述。

1 染色體脆性位點(fragile site)

1.1 染色體脆性位點

染色體脆性位點(fragile site)包括39個稀有型脆性位點(rare fragile site)和88個普通型脆性位點(common fragile site,CFS)[1,2]。1984年普通型脆性位點被發現[3]，當受到某些因素的作用時DNA復制被抑制，染色體會在有絲分裂中期形成缺口或斷裂區。葉酸可以誘導稀有型脆性位點的出現，但是僅在少數人群(小于2.5%)的基因組發生，其與三核苷酸重復序列的擴增有關 (例如FA RXA 基因CCG重復擴增導致脆性X-染色體綜合癥)，稀有型脆性位點與癌癥無相關性。與稀有脆性位點不同，CFS可以在所有個體的染色體基因組中被誘導[1]；CFS進化上保守[2,4]，研究熱度越來越高主要有兩個原因：首先，導致CFS形成的因子和條件可以被鑒定；其次，CFS與腫瘤(包括癌基因)中的周期性染色體重排相關聯，CFS可能是導致染色體重排的重要原因[5]，是腫瘤發生或腫瘤進展的驅動因素[6]。Casper等[4]研究表明：ATR是參與DNA損傷反應信號傳導的細胞周期節點蛋白，ATR激酶調控CFS位點的穩定性，但是同樣參與DNA損傷反應信號傳導的細胞周期節點蛋白ATM卻不參與CFS穩定性的調控，提示DNA損傷反應信號傳導通路與CFS區域的基因組穩定性可能存在著錯中復雜的關系；近年來，研究發現CFS經常位于DNA遲復制區，一個普通型脆性位點FAR3B順序遲復制，在誘導劑處理后在G2期中仍有16.5% FRA3B順序未被復制，因此脆性位點遲復制DNA對復制抑制劑的進一步抑制效應特別敏感[7]。CFS的特點之一是富含AT二核苷酸的重復序列，從而使DNA扭曲可變性增大[8,9]，大都與染色體DNA缺失相關的腫瘤發生相關[10,11]。

1.2 染色體脆性位點與腫瘤

許多研究已經證明CFS與腫瘤發生的相關性[7,12-17]，在腫瘤中需要逐個研究CFS中缺失的基因，從而探討CFS與在腫瘤中的作用機制。抑癌基因的研究目前已經成為腫瘤學研究的熱點，發現新的抑癌基因并證明其與細胞惡性轉化的作用及機制已成為腫瘤發生學的重要內容。在惡性腫瘤中CFS基因出現缺失，提示CFS基因在腫瘤發生發展中可能具有重要的生理功能。FHIT(一種二核苷三磷酸酶)，WWOX(一種氧化還原酶)和其他幾種CFS相關基因已被確認為抑癌基因，大多數關于CFS基因的功能研究也集中在FHIT和WWOX，它們的缺失可能導致腫瘤發展[11,18]。研究表明這些基因的缺失和/或表達降低是多種腫瘤預后不良的預測因子，有許多關于基因組改變和癌前病變中蛋白質表達缺失的報道，表明腫瘤抑制作用始于癌癥發展的早期階段[19,20]。FHIT表達的缺失是通過啟動子甲基化和/或缺失造成的，這種缺失機制與多種腫瘤的進展和存活率的降低相關[20-22]。WWOX基因純合子和半合子缺失在多種腫瘤出現，并且在人類的多種腫瘤中都有WWOX滅活，實驗證明WWOX缺失的小鼠29%自發生瘤，WWOX缺失加化學致癌物誘導可使動物的發病率高達96%，其中27%具有侵襲性[18,23]。最近，PARK2將它們與培養細胞和小鼠癌癥模型中的DNA損傷反應聯系起來[11]。據報道，FHIT的缺失導致dNTP失衡和自發復制應激[24]，并且WWOX在ATR介導的DNA損傷檢查點應答激活中起關鍵作用[25]。與這些假設一致，Fhit和Wwox缺陷小鼠都表現出腫瘤發病率增加和對致癌物誘發的腫瘤的易感性的升高[26,27]。在缺失WWOX的腫瘤細胞中異位表達的WWOX可以抑制免疫受損小鼠中的細胞和腫瘤生長，同時缺失WWOX的小鼠中骨肉瘤，肺和乳腺癌的發生率更高[28]。但是FHIT和WWOX在DNA損傷反應中的作用機制并不完全清楚。

CFS發現已有三十多年的歷史[1,2,15,29]，但是由于缺少鑒定CFS的方法，CFS的研究出現瓶頸，其生物學功能以及作用機制仍不清楚。近年來，有學者發現在 CFS區域分布著一些microRNA，并且這些microRNA與腫瘤發生和預后有一定的關系[30,31]，但卻沒有足夠的證據其表明是否與染色體脆性位點相關，microRNA與染色體脆性位點的關系及其在腫瘤發生發展中的意義仍有待進一步研究。因此尋找并確定CFS位點新基因并闡明其生物學行為，研究其對腫瘤的調控機制以及臨床轉化研究具有重要意義，并有可能應用于腫瘤的分子診斷和風險預測。

2 FATS (fragile-site associated tumor suppressor)基因

2.1 FATS基因的發現

用p53雜合子近交系C57BL/6J小鼠建立自發淋巴瘤模型，由于γ-射線輻射顯著增加p53缺陷小鼠的致瘤率，對5周齡實驗組p53雜合子小鼠實施一次單劑量(4Gy)γ-射線照射，同時建立小鼠誘發淋巴瘤模型[32,33]。6-12個月后，收集并提取小鼠腫瘤的基因組DNA，對照組提取未經照射處理的正常p53雜合子小鼠基因組DNA。利用覆蓋95%以上小鼠基因組的BAC微陣列DNA芯片，對32個自發淋巴瘤DNA樣品和29個DNA損傷誘發淋巴瘤DNA樣品進一步利用微陣列比較基因組雜交Array-CGH(microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH)分析，掌握小鼠腫瘤全基因組缺失或擴增圖譜，分辨率為200kb。根據普通型脆性位點基因在進化上的保守性，著重分析在DNA損傷誘發淋巴瘤中的染色體缺失區域，結合生物信息學研究，確定在某些高頻缺失區域存在一些已知的抑癌基因(例如TCR?， p63等)，證明所獲得的小鼠誘發淋巴瘤基因組圖譜的可靠性和真實性。我們進一步發現在小鼠第七號染色體末端有一個缺失頻率很高的區域(約200kb)，這個區域在小鼠誘發淋巴瘤的缺失頻率比在自發淋巴瘤中高6倍，而且DNA序列分析顯示在這個對DNA損傷敏感的區域存在一個未被國際同行研究過的新基因我們將其命名為FATS(fragile-site associated tumor suppressor)。對小鼠誘發淋巴瘤第七號染色體的Array-CGH 圖譜，箭頭所指處的高頻缺失區域進一步進行生物信息學研究表明：這一區域在DNA損傷誘發淋巴瘤 (IR+)中的缺失頻率為70% (n=29)，但在自發淋巴瘤(IR-)中的缺失頻率下降為10% (n=32)。高頻缺失區域對應BAC克隆為RP23-35I7。人類FATS基因結構以及在10號染色體脆性位點FRA10F的定位。紅色熒光原位雜交信號顯示探針BAC克隆RP11-179O22。FRA10F在正常人細胞中的出現頻率小于1%[34](圖1)。這驗證了Array CGH技術應用于DNA損傷誘發小鼠腫瘤模型是發現CFS基因的新途徑。

A.利用比較基因組雜交(CGH)技術,對遺傳背景一致的p53(+/-)小鼠淋巴瘤進行全基因組掃描分析 B.腫瘤基因組7號染色體基因拷貝數擴增及缺失的代表性圖譜。FATS基因位于近端粒區的一個顯著缺失位點(箭頭所指處) C.FATS基因結構示意圖：生物信息學分析結果表明：該基因最大編碼外顯子區(編碼N端363個氨基酸殘基)在腫瘤中的缺失頻率很高,并且對DNA損傷極其敏感,具有統計學意義(P<0.001,n=29)。IR：離子輻射

圖1 FATS新基因的發現

2.2 FATS基因與腫瘤的基礎研究

FATS 基因的內含子和表達調控區含有豐富的AT重復序列，具有典型的脆性位點基因特征。FATS是本課題組在國際上首先發現的與DNA損傷誘發腫瘤相關的抑癌基因，定位于10q26.2，熒光原位雜交(FISH)實驗證實FATS位于染色體脆性位點FRA10F上[34]。由于多種腫瘤在這一位點出現雜合子丟失(loss of heterozygosity,LOH)，因此FATS基因可能與人類腫瘤的發生有著密切的關系。進一步發現， FATS 基因不僅在乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者DNA中存在顯著的缺失， RT-PCR檢測發現在與相應正常細胞和癌旁組織比較FATS mRNA表達水平在多種癌細胞和腫瘤組織中出現降低甚至不表達，將 FATS 表達載體共轉染細胞后，呈現明顯的體外(in vitro)和體內(in vivo)抗腫瘤活性[35]。FATS 基因是如何抑制腫瘤發生發展的機制已經取得重要進展，研究發現FATS基因的表達能顯著誘導p21的蛋白表達量，p21是調控細胞周期的重要的抑制性因子，從而使細胞周期阻滯于G1期[34]。使用射線或者藥物誘導DNA損傷，FATS可以更加有效的使細胞周期阻滯于G1期。在MEF細胞中應用FATS- siRNA抑制FATS 基因表達，同時誘導DNA損傷，發現細胞進入有絲分裂期的比例增高，提示G2/M細胞周期節點(checkpoint)功能受損[34]。應用熒光顯微鏡，發現在DNA誘導損傷和 抑制FATS 表達后，進入M期的細胞存在嚴重的胞質分裂缺陷、并影響細胞有絲分裂中著絲粒(centrosome)的正常分布，表明 FATS 基因表達對維持基因組穩定性(genomic stability)有重要影響[35]。

FATS 是一個有重要生物學功能的腫瘤分子標記物，初步研究證實：FATS 通過與組蛋白去乙酰化酶HDAC1發生蛋白質相互作用，抑制HDAC1對p21蛋白的去乙酰化而增加細胞內p21蛋白的穩定性和豐度，對維持基因組穩定性有重要作用[34]。雖然FATS在轉錄水平受p53抑癌基因的調控，但在p53失活后 FATS 表達仍具有抗腫瘤活性[35]。由于 FATS 基因在DNA損傷誘發的腫瘤中缺失頻率增加與p53雜合型缺失的遺傳背景有關，而且p53對DNA損傷修復有重要調控作用[36],進一步推測 FATS 對p53的表達可能有影響。為驗證這一實驗假說，首先將 FATS 表達載體共轉染，免疫印跡實驗結果顯示 FATS 基因表達可顯著誘導細胞內p53蛋白的表達水平增高。用小分子RNA抑制 FATS mRNA 的表達，細胞中p53蛋白表達水平隨之下降，提示 FATS 基因的表達對于維持p53蛋白表達水平是必需的。這些初步研究結果提示 FATS 和p53這兩個抑癌基因之間存在相互調控關系，即：FATS 基因的轉錄受p53調控[35]， FATS 基因的表達反過來又提高p53的蛋白表達水平[37]。對FATS功能在細胞水平上的基礎性研究證實：FATS參與DNA損傷反應和細胞周期調控，FATS蛋白 N-端(67-175)區域直接結合組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)、增強細胞周期負調控因子p21的乙酰化修飾，進而抑制蛋白酶體C8亞單位與p21蛋白C-端的結合和蛋白酶體對p21的直接降解[34]。通過篩選小鼠睪丸cDNA文庫，本實驗室在國際上首次發現一個FATS mRNA剪接異構體(GenBank 收錄號GQ499374)，以此確定FATS啟動子區序列,并證實FATS在轉錄水平受p53激活[35]。最新的研究成果表明FATS蛋白的N端(1-67)區域與p53蛋白發生直接相互作用，FATS表達能增強p53蛋白的表達水平[38]。進一步發現FATS是一個獨特的不依賴于泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)的泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)。與以往發現的E3不同，FATS對p53的多聚泛素化修飾并不導致p53降解，相反，FATS增強p53蛋白的轉錄因子活性和穩定性。體外泛素化實驗結果證實：FATS對p53的多聚泛素化修飾并不通過K-48單一泛素鏈介導，而是由K63-、K11-、和K29-三種泛素鏈組成[38]，這種多聚泛素鏈可形成非線性的分枝狀結構。我們在國際上首次發現：FATS介導的p53泛素化修飾水平在DNA損傷后伴隨著p53的激活而增強，并促進p53在DNA損傷后磷酸化和乙酰化修飾水平的增高[38]。

FATS作為p53的轉錄靶點，FATS與Mdm2競爭與p53和多聚泛素化p53形成復合物，導致p53功能的穩定和完全激活[38]。FATS還能獨立泛素化穩定p21，在DNA損傷后嚴格控制細胞周期檢查點，進一步保證p53-p21通路抑制腫瘤發生的功能。FATS基因位于容易受到DNA損傷的基因組區域，這可能是其在腫瘤基因組中經常缺失和廣泛下調的原因。p53的充分激活可能有助于在DNA復制和DNA損傷下積極修復FATS位點的損傷，從而維持FATS基因的表達和功能[34,35,38](圖2)。

2.3 FATS基因的臨床轉化研究

臨床轉化研究顯示 FATS 基因的功能性變異rs11245007(905C>T，262D/N)其病例對照研究發現，CT或TT基因型對妊娠≥3胎的婦女罹患乳腺癌具有保護作用，其不受家族史的影響[39]。更重要的是，最新的 FATS 轉化醫學研究結果提供了 FATS mRNA 表達異常與乳腺癌和非小細胞肺癌發生的直接證據:在23例配對乳腺癌組織和15例配對肺癌組織中，FATS mRNA 在腫瘤組織中的表達水平與來自同一個體的正常組織相比(表達異常率100%)均有不同程度降低或沉默[37,40]。在對乳腺癌的臨床轉化研究中我們發現：FATS 高表達比 FATS 低表達患者有更好的預后(P=0.006)，通過多因素分析 FATS 高表達是接受放療乳腺癌患者的獨立預后因素(P=0.012)[37]。進一步，我們通過克隆形成實驗，發現高表達 FATS 可增加乳腺癌細胞的放療敏感性，敲低 FATS 導致乳腺癌細胞放療抗拒，證實 FATS 的確調控乳腺癌放療敏感性[37]。接下來應用 FATS 過表達載體 3xFlag-FATS 轉染MDA-MB-231細胞，同時用 FATS 干擾質粒 FATS-shRNA 轉染MDA-MB-231細胞作為對照，通過6Gy/f的x線照射后，運用流式細胞術觀察，結果顯示：提高 FATS 表達水平后，其對放療更加敏感，我們同時檢測了凋亡蛋白Cleaved PARP，結果顯示：FATS 高表達組Cleaved PARP 明顯升高。這些研究結果提示放療后 FATS 調控了細胞凋亡從而提高放療敏感性[37]。但是 FATS 調控細胞凋亡的分子機制仍待闡明，我們推測可能與p53蛋白的相互作用相關。在對肺癌的研究中發現：在接受鉑類聯合化療的患者中， FATS mRNA高表達較低表達預后更好；而未接受含有鉑類化療的患者，FATS mRNA表達水平則與患者預后無關，這提示FATS高表達與鉑類藥物化療敏感性相關[40]。進一步將FATS過表達質粒轉染肺癌細胞系H1299和A549，并應用順鉑對細胞進行殺傷，我們發現FATS過表達可以增強順鉑對肺癌細胞的殺傷能力，并增加順鉑誘導的細胞凋亡率[40]。FATS可能通過調節DNA損傷后細胞周期節點調控功能、維持基因組穩定性、并抑制腫瘤細胞中DNA修復異常，從而增強鉑類化療藥物的抗腫瘤療效。

圖2 FATS抑癌分子機制示意圖

3 研究的意義與展望

近年來，對于脆性位點的研究越來越多，CFS位點基因具有進化上保守、與腫瘤發生發展密不可分、同時可能還參與調控DNA損傷反應信號通路，尋找確定CFS位點基因的新途徑、發掘和鑒定新的CFS基因并闡明CFS基因與癌癥發生的關系是一個頗具挑戰性的前沿課題，最新發現FATS基因極有可能是腫瘤發生早期起關鍵調控作用的候選分子標志物，并可應用于癌癥的分子診斷和風險預測，對研究腫瘤的發生發展具有重要意義，可為預防和治療腫瘤提供新的策略,但是 FATS 的分子調控機制仍待進一步闡明。