抗氧化應激相關因子水平對老年腦外傷患者康復過程的影響

蔣華 胡顯靜 黃昌堯 王時強 李瑞

(黔西南州人民醫院神經外科，貴州 興義 562400)

腦外傷(TBI)是指由穿透、鈍擊、加/減速力導致的顱腦創傷，可嚴重影響患者的意識、神智、記憶或導致其他神經病學/神經心理學的異常，嚴重的腦外傷甚至可導致死亡，其致死率和致殘率極高〔1〕。老年TBI患者的發病率逐年升高，合并患有多種基礎疾病，預后效果差，采取針對性治療措施具有重要意義〔2〕。

現有研究表明TBI的康復過程涉及人體內的氧化和抗氧化系統的相互作用〔3〕。TBI發生后，易出現腦組織缺血缺氧，產生大量活性氧(ROS)，當ROS產生量超過機體承受能力時機體可產生氧化應激，起到保護機體免受氧化損傷的作用〔4〕。人體內抗氧化應激相關因子有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽還原酶(GR)，小分子丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)等，這些抗氧化應激相關因子的含量或活性與TBI的康復有著密切的聯系〔5〕。本研究通過揭示抗氧化應激相關因子與TBI等級之間的關系，為TBI臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要材料 Trizol試劑、TaqMan逆轉錄試劑盒(美國，Life Technologies公司)，qRT-PCR試劑盒(美國，GeneCopoeia公司)，BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(美國，BioRad公司)，紫外可見分光光度計(美國，Thermo公司，Nanodrop 2000)，Multiskan MK 3酶標儀(美國，Thermo公司)，FS-1型電動勻漿器(江蘇，新瑞儀器)，GSH、GSSG檢測試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)，SOD鄰苯三酚自氧化法活性檢測試劑盒、CAT過硼酸鈉作底物滴定法活性檢測試劑盒、MDA硫代巴比妥酸法含量檢測試劑盒(南京，建成生物工程研究所)。

1.2方法 于2010年1月至2015年1月選取經黔西南州人民醫院確診的15例老年創傷型腦損傷患者(TBI組)和15例老年健康志愿者(對照組)，分別檢測血清樣本中抗氧化應激相關酶SOD、CAT、GPX和GR的活性或表達，檢測抗氧化應激相關小分子MDA、GSH和GSSG的含量。

另選取35例老年TBI患者，其中男29例，女6例，年齡60～78歲，平均(68.27±5.08)歲。另外選取性別及年齡分布與TBI患者一致的35例老年健康志愿者，參與SOD、CAT和MDA的測定，取平均值，以其平均值作為分界點，分別統計TBI患者在各傷殘等級的人數分布，分析TBI等級(三級和四級，一級和二級)和SOD、CAT、MDA水平(≥健康志愿者平均值，<健康志愿者平均值)之間的相關性。研究方案經醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.3RNA提取和純度、濃度測定 RNA提取：分別取TBI組及對照組的靜脈血各約2 ml，4℃放置2 h，轉速9 000 r/min離心10 min，收集上層血清。所取得的血清量200～500 μl，分別加入血清體積3倍量的TRIzol裂解液(假設所加裂解液的體積為V)，室溫下靜置5 min，加入1/3V氯仿，劇烈震蕩15 s，靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層液體到另一EP管中，加入2/3V異丙醇，混勻后，室溫下靜置10 min，離心、棄上清。加入75% 4/3V乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無RNase雙蒸水，充分溶解后，取1 μl測定RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-80℃環境中，備用于qRT-PCR檢測。將分裝出的1 μl總RNA用于濃度測定。

濃度和純度以紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop2000)測定。先以1 μl的RNAase-free水作空白校對測定。測定波長260及280 nm的光密度(A)，計算其比值。當測定值小于3時方可正常進行RNA樣本測定。RNA樣本測定前給予速度離心，以使充分混勻，記錄所測濃度值和A260/A280值。當A260/A280在1.8～2.0時表示RNA的純度適中，所提取的RNA可用于后續實驗，否則應予調整。

1.4qRT-PCR檢測 測定方法：以1.3中提取的血清總RNA為模板，按TaqMan的逆轉錄試劑盒說明書進行操作，逆轉錄生成cDNA，以cDNA為模板，按GeneCopoeia公司的qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，檢測設備為BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(美國，BioRad)。

引物均由美國Invitrogen公司合成，其中CAT正義鏈：5'-GCCACAGGAAAGTACCCCTC-3'，反義鏈：5'-CGGTGAGTGTCAGGATAGGC-3'，擴增長度為281 bp。SOD正義鏈：5'-ACAAAGATGGTGTGGCCGAT-3'，反義鏈：5'-AACGACTTCCAGCGTTTCCT-3'，擴增長度為162 bp。GPX正義鏈：5'-AAGGCCGAGTATCCGATTT-3',反義鏈：5'-GCGAGCAGCTTCTTGAGG-3',擴增長度為308 bp。GR正義鏈：5'-TTACGCCAAGTTATTTAGGTGACA-3',反義鏈：5'-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA3-3'，擴增長度為236 bp。其中β-actin為內參，正義鏈：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反義鏈：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，擴增長度為268 bp。2-ΔΔCt用于計算相對表達量。反應體系為20 μl，每組實驗設置3個復孔。

1.5硫代巴比妥酸法測定MDA的含量 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照試劑盒說明書進行操作，用硫代巴比妥酸法測定所有樣本的血清中MDA的含量以532 nm比色測定的OD值與四乙氧基丙烷標準曲線查出對應濃度，再乘以68.89即為血清中MDA的含量。

1.6過硼酸鈉作底物滴定法測定CAT的活性 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照試劑盒說明書進行操作，用過硼酸鈉作底物滴定法測定所有樣本血清中CAT的活性。取干凈的錐形瓶，按照說明書操作，每只中分別加入50 mmol/L的磷酸緩沖液和100 mmol/L的過硼酸鈉，混勻，置于20°的水浴鍋中加熱10 min，加入待測的血清樣品，達到所需的反應時間時，加入1 mol/L硫酸終止反應，用10 mmol/L的高錳酸鉀液滴定測定CAT的活性。

1.7鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性 提取TBI組及對照組的靜脈血血清，按照說明書進行操作，樣品孔和樣品空白對照中分別加入血清樣品，在不含抑制劑的空白對照和試劑空白對照中分別加入雙蒸水。每孔均加入四氮唑(WST)工作液，混勻。樣品空白對照和試劑空白對照中分別加入稀釋緩沖液。樣品孔和不含抑制劑的空白對照中分別加入酶工作液，混勻。37℃培養箱中培養20 min，用酶標儀在450 nm處讀數。

1.85,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)速率比色法測定GSH和GSSG含量 試液配制：按說明書進行操作，分別配制GSH標準儲存液(10 mmol/L)，50×GSH還原酶，GSH檢測工作液，總谷胱甘肽(T-GSH)檢測工作液，標準品和NADPH工作液。樣本制備時盡量使用新鮮的血液進行測定，樣本先4℃度放置2 h，轉速9 000 r/min離心10 min，收集上層血清，加入蛋白沉淀工作液，充分振勻，4℃或冰浴放置，離心，取上清用于T-GSH含量測定。

測定操作：分別設置空白、標準和測定管，按說明書提供的順序依次加入。按照動力學測定法，在酶標儀上的410 nm處每2 min檢測一次吸光度值，采用空白管調零，總檢測時長為6 min，檢測其反應速率ΔA/min(濃度為橫坐標，ΔA410/min為縱坐標，做標準曲線)。根據待測ΔA410/min和標準曲線計算GSH和T-GSH含量。其中GSSG含量=T-GSH含量-GSH含量。

1.9TBI患者的世界衛生組織殘疾評定方案2.0(WHO-DAS Ⅱ)評定 WHO-DASⅡ是世界衛生組織制定的用于殘疾等級評級的標準，使用WHO-DAS Ⅱ國際中文版檢查者評定版問卷(http://www.who.int/classifications/icf/more_whodas/en/)，從理解交流、身體移動、生活自理、與人相處、生活活動、社會活動6個方面對TBI患者的整體功能進行綜合評估，共36項評估指標。其中WHO-DAS Ⅱ總分值<52分為正常，即不存在障礙；52～95屬于殘疾四級，為適應行為輕度障礙；96～105分屬于殘疾三級，為適應行為中度障礙；106～115分屬于殘疾二級，為適應行為重度障礙；≥116分屬于殘疾一級，為適應行為極重度障礙〔6〕。按照各項指標的嚴重程度(無，輕度，中度，重度，極重度)統計各項人數。

1.10統計學處理 使用SPSS15.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1TBI組及對照組血清MDA含量及SOD、CAT、GSH和GSSG活性比較 和對照組相比，TBI組血清SOD、CAT和GSH活性顯著降低，而MDA和GSSG的含量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 TBI組及對照組血清MDA含量、SOD、CAT、GSH、GSSG活性比較

2.2TBI組及對照組血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表達比較 和對照組相比，TBI組血清SOD、CAT和GR mRNA表達水平顯著降低，而GPX mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 TBI組及對照組血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表達比較

2.3WHO-DASⅡ評定結果 在35例TBI患者中，WHO-DAS Ⅱ評分一級8例，二級10例，三級6例，Ⅲ級11例。

2.4TBI患者的殘疾等級與MDA，SOD和CAT的關聯性 35例老年健康志愿者MDA的含量為4.84 nmol/g，SOD的活性為62.31 U/mg，CAT的活性為12.07 U/mg。

35例老年TBI患者MDA，SOD和CAT資料按健康者的對應平均值分層后進行比較，結果顯示：TBI患者的殘疾嚴重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性則愈低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TBI患者的殘疾等級與MDA、SOD和CAT的關聯性

3 討 論

TBI是所有類型的創傷中危害最大的一種類型，其發生率高，致死率高，致殘率也高〔7，8〕。通常TBI患者可經過搶救而幸存，但TBI常常會對患者產生較嚴重的生理和心理影響，例如在生理上，TBI可導致患者的運動障礙、神經傳導障礙、感覺障礙、語言障礙、自主意識障礙等；在精神上，TBI可導致患者產生恐懼感或不安全感等〔9〕。隨著我國人民生活水平高的日益提高，老年人的壽命逐漸增長，同時機體各項功能減退，老年人的腦部存在不同程度的萎縮，增加顱內緩沖空間，臨床陽性癥狀不明顯，容易造成漏診〔10〕。近年來，多項研究報道指出氧化應激在TBI康復中發揮著極其重要的作用〔11～14〕。但人體本身的中樞神經系統具有耗氧量高和脂質含量豐富的特點，因此較容易發生脂質過氧化的現象，最終可導致對神經元的損傷，由于中樞神經系統對氧化損傷十分敏感，因此此時中樞神經系統會調用其本身的內源性抗氧化酶防御系統以維持細胞的氧化還原平衡〔15，16〕。人體內的氧化和抗氧化系統，相互依賴，相互制約，共同維持人體內環境的平衡〔17〕。

人體內的抗氧化系統主要有兩大類。一類為抗氧化酶類，包括SOD、CAT、GR、GPX、谷胱甘肽轉移酶、血紅素氧合酶1等〔18,19〕。另一類為非酶性抗氧化劑，包括GSH、硫基蛋白、銅藍蛋白、轉鐵蛋白、N-乙酰半胱氨酸、維生素C、脂溶性的抗氧化物質MDA、水溶性抗氧化物質等〔20,21〕。本研究結果表明腦損傷導致機體抗氧損傷相關的酶和產物SOD、CAT、GSH和GR的表達和活性均降低，而脂質氧化損傷后的產物MDA，GSSG和GPX表達均增加。本研究發現發現這35例老年患者均存在不同程度的障礙。且通過與老年健康志愿者的MDA，SOD和CAT含量/活性平均值比較，我們發現老年TBI患者的殘疾嚴重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性則愈低,即老年TBI患者的殘疾程度與MDA、SOD和CAT有關。后續研究擬收集老年TBI患者的臨床病理學參數，分析MDA、SOD、CAT這三者與老年TBI患者生存、預后和其他病理學參數之間的相關性，進一步明確它們之間的關系，期望進一步探究TBI康復中的抗氧化應激機制，期望為TBI的臨床藥物開發提供的新的思路。