10種菊屬植物花序不同成分含量比較

姜自紅

(滁州職業技術學院 食品與環境工程學院， 安徽 滁州 239000)

0 引言

野菊花和菊花(茶用菊品種)均為菊科菊屬多年生草本植物，黃酮類化合物、綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為菊花有效成分[1-4]. 現代研究表明，菊花中的這些成分具有抗氧化、抗癌和治療心血管病的功能[5-9]. 我國菊屬植物種質資源豐富，菊花品種多，野菊種類多[10]. 目前國內已有大量文獻報道菊花或野菊中總黃酮含量和綠原酸等有機酸類的提取方法和含量[11-15]，但沒有將茶用菊花和野菊的這些成分的含量進行綜合比較. 本研究比較了茶用菊花和野菊不同植物花序有效成分含量差異，為菊花品種改良和野菊資源的開發利用提供了參考.

1 原料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗材料：5種茶用菊，即大白菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Dabaiju’)、亳菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Bozhou’)、滁菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Chuju’)、黃山貢菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Gongju’)、金絲皇菊(D.morifolium(Ramat.) Tzvel. cv.‘Jinsihuangju’)；5種野菊，即薩摩野菊(D.ornatum)、野路菊(D.japonense)、乙立寒菊(D.indicumvar.maruyamanum)、陰岐油菊(D.okiense)、紫花野菊(D.zawadskii(Herb.) Tzvel). 本試驗所用材料均取自南京農業大學瑣石村菊花實驗基地，為基地種質資源圃對應種(品種).

主要試劑：亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等(分析純)購自南京化學試劑有限公司，甲醇、乙腈(色譜純)購自天津科密歐化學試劑有限公司，盧丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所，標樣樣品為上海源葉生物科技有限公司HPLC提供.

主要儀器：LC-1260高效液相色譜(安捷倫)、Cytation3細胞成像多功能檢測儀(BioTek)、VGT-2013QTD型號超聲波水浴鍋(昆山市超聲儀器有限公司)、Scientz-48組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司).

1.2 材料處理方法

于2017年秋季選取開放程度達到70%左右的菊花，確保花朵大小、質量相近. 用清水沖洗，晾干后置于80 ℃烘箱中烘干至恒重，取適量干花樣品，剪碎后統一置于5 mL離心管中并加入小鋼珠2粒，使用液氮冷凍后立即使用Scientz-48組織研磨器粉碎20 s，至材料變為細膩的粉末.

1.3 總黃酮的含量測定方法

總黃酮的含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定[16].

1.3.1 供試品溶液的制備

取干花粉0.1 g共3份，加70%的乙醇9 mL為溶劑. 于60 ℃超聲恒溫水浴鍋中浸提30 min，以4 000 r/min離心10 min后取上清液，重復提取2次，合并后定容至25 mL，為供試溶液.

1.3.2 對照品溶液的制備

取蘆丁對照品于80 ℃烘箱中烘至質量恒定，取5.5 mg的樣品以70%乙醇溶液為溶劑，待完全溶解后定容至10 mL，此為對照品溶液.

1.3.3 線性關系

分別精確吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL的對照品溶液至6支不同試管中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]，反應后用70%乙醇溶液補足至10 mL. 待溶液顯色后以蘆丁空白為對照，置于酶標儀中于510 nm 波長處進行比色測定其吸光度，并求出回歸方程.

1.3.4 樣品含量的測定

分別精確吸取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL離心管中，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]，反應后用70%乙醇溶液補足至10 mL. 顯色后于波長510 nm進行測定，用酶標儀測出各樣品的OD值，利用回歸方程和公式計算出各個樣品的總黃酮質量分數.

樣品總黃酮質量分數(mg/g)=(C×V2×V0)/(V1×M).

式中：C為質量濃度，M為樣品初始質量，V0為供試液的體積，V2為最終稀釋的體積，V1為1 mL.

1.4 綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量測定方法

參考2015年版《中華人民共和國藥典》對菊花中的綠原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量的測定方法，選用高效液相色譜法(UPLC)進行測定[17].

1.4.1 供試品溶液的制備

取3份干花粉末各0.25 g，加入70%的甲醇9 mL為溶劑，于60 ℃超聲水浴鍋中恒溫浸提30 min，以4 000 r/min離心10 min取上清液. 重復提取2次，合并上清液定容至25 mL. 搖勻并靜置后使用微孔濾膜(0.22 μm，有機相)過濾，備用.

1.4.2 對照液的制備

取綠原酸樣品360 μg、木犀草苷樣品270 μg及3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸樣品650 μg，加入70%的甲醇溶解并定容至10 mL. 取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL標準品混合液，加70%甲醇定容至10 mL，于4 ℃冰箱中保存.

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以質量分數為0.1%的乙酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫：柱溫為30 ℃，流速為0.4 mL/min，檢測波長348 mn，樣品進樣量為5 μL. 理論板數按3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰計算應不低于8 000.

1.4.4 線性關系

取各濃度的對照溶液，置于進樣瓶中，進樣量為5 μL，按照1.4.3的色譜條件進行測定.以對照品進樣濃度(X)為橫坐標，峰面積值(Y)為縱坐標進行線性回歸.

1.4.5 樣品含量的測定

取適量供試液樣品，進樣量為5 μL，按照1.4.3的色譜條件進行測定.

樣品質量分數(%)=(C×V0)/M.

式中：C為質量濃度，M為樣品初始質量，V0為最終稀釋的體積.

1.5 數據分析

用SPSS 20.0進行數據統計分析，用Duncan的新復極差法檢測差異顯著性.

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量

表2 10種菊屬植物總黃酮質量分數

注：樣品間做差異顯著性分析，表中數值后不同大、小寫字母分別表示處理間差異達0.01和0.05顯著水平(Duncan新復極差法).

以蘆丁質量濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到

y=0.009 7x+0.016 7，R2= 0.999，n=3.

測得10種菊屬植物花序總黃酮質量分數見表2，10種菊屬植物的總黃酮質量分數在8.3～29.7 mg/g之間，多數樣品總黃酮質量分數在10～20 mg/g之間，但差異不顯著. 野菊品種中紫花野菊、野路菊的總黃酮質量分數分別為29.7 mg/g和24.6 mg/g，顯著高于多個茶用菊品種. 10種菊屬植物的總黃酮含量順序為：紫花野菊>野路菊>大白菊>黃山貢菊>薩摩野菊>陰岐油菊>滁菊>金絲皇菊>亳菊>乙立寒菊.

2.2 綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量

對照品(A)與樣品(B)的HPLC圖譜見圖1.綠原酸回歸方程為y=789.48x-0.208，R2=0.999 6，n=3，綠原酸濃度在3.6～72 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系；木犀草苷回歸方程為y=1 865.9x-0.592 6，R2=0.999 6，n=3，木犀草苷濃度在6.5～130 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系；3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸回歸方程為y=642.99x-0.536 1，R2=0.999 6，n=3，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸濃度在2.7～54 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系.

123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5123t/min2.55.07.510.012.515.017.520.022.5A.對照品B.樣品

1.綠原酸； 2.木犀草苷； 3. 3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸

圖1 對照品與樣品的HPLC圖譜

測得10種菊屬植物綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸質量分數結果見表3. 結果顯示：多個樣品中可檢測出3個活性成分，但陰岐油菊材料未檢測出綠原酸含量，可能是該品種綠原酸含量較低.

表3 10種菊屬植物綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸質量分數

注：樣品間做差異顯著性分析，表中數值后不同大、小寫字母分別表示處理間差異達0.01和0.05顯著水平(Duncan新復極差法).

10種菊屬植物的綠原酸質量分數在0.34%～1.93%之間，除陰岐油菊外，均高于《中華人民共和國藥典》規定的質量分數不少于0.2%的要求. 不同菊屬植物的綠原酸含量差異顯著，其中乙立寒菊的綠原酸質量分數達1.93%，顯著高于其他材料，不同野菊種間綠原酸含量差異顯著. 茶用菊品種中黃山貢菊的綠原酸質量分數最高，為0.65%，各茶用菊品種綠原酸含量存在差異. 各材料綠原酸含量順序為乙立寒菊>紫花野菊>野路菊>黃山貢菊>金絲皇菊>大白菊>亳菊>滁菊>薩摩野菊>陰岐油菊.

10種菊屬植物的木犀草苷質量分數在0.53%～2.33%之間，均遠高于《中華人民共和國藥典》規定的質量分數不少于0.08%的要求. 各材料的木犀草苷含量差異顯著，其中野路菊質量分數最高達1.33%；茶用菊品種中滁菊質量分數最高，為1.29%. 各材料的木犀草苷含量順序為野路菊>滁菊>大白菊>黃山貢菊>薩摩野菊>紫花野菊>亳菊>金絲皇菊>陰岐油菊>乙立寒菊.

10種菊屬植物的3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸質量分數在0.38%～3.50%之間，其中7種材料的3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量高于《中華人民共和國藥典》規定的質量分數0.7%的最低要求. 不同菊屬植物間3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量差異顯著，其中乙立寒菊的質量分數最高，為3.5%；茶用菊品種中黃山貢菊質量分數最高，為2.29%. 各材料的3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量順序為乙立寒菊>黃山貢菊>野路菊>紫花野菊>金絲皇菊>滁菊>>薩摩野菊>大白菊>亳菊>陰岐油菊.

圖2 10種菊屬植物花序有效成分含量聚類分析

2.3 聚類分析

根據4個有效成分的分析數據，運用SPSS 20.0軟件對10種菊屬植物進行了Q型聚類分析，詳見圖2. 根據圖2結果可知，菊屬植物在閾值為25時分為兩大類，即野路菊、紫花野菊為一類，其他菊屬植物為一類. 當閾值為5時，菊屬植物被分為4小類，即亳菊、金絲皇菊、滁菊、薩摩野菊、陰岐油菊為一類，大白菊與黃山貢菊為一類，乙立寒菊為一類，野路菊與紫花野菊為一類. 結果表明，多種菊屬植物的花序有效成分具有一定的相似性.

3 討論

除陰岐油菊材料未檢測到綠原酸外，各試驗樣品中基本可檢測到4種活性物質的存在，且測得的綠原酸、木犀草苷及3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量均高于2015 年版《中華人民共和國藥典》規定的相關含量標準. 所測菊屬植物材料的活性物質含量差異顯著，其中紫花野菊總黃酮含量最高，乙立寒菊的綠原酸含量最高，野路菊的木犀草苷含量最高，乙立寒菊的3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量最高，說明多種野菊材料的一個或多個活性物質含量高于茶用菊品種.

部分野菊與多種茶用菊花序有效成分含量上具有相似性，有入藥潛質，或可作為茶用菊的遠緣雜交材料，用于豐富現有茶用菊種質資源，選育具有較高活性成分含量或優良性狀的菊花品種.