間充質干細胞因子群對角膜損傷藥效研究及臨床初探

梁璐，馬濤，王斌，韓忠朝

（1.天津百恩生物科技有限公司天津 300308；2.北京漢氏聯合生物技術股份有限公司北京 100176）

角膜作為高度特化、復雜的器官，經常因為炎癥或外傷等因素導致過度血管化、結膜化、角膜瘢痕，而引起角膜透明度下降甚至失明。治療中應盡可能恢復角膜的完整性和透明度，角膜損傷治療的首要策略是控制炎癥，防止感染，必要時進行手術治療例如金剛砂車針、格狀切開或者結膜瓣遮蓋術等?，F有的促角膜修復的藥物較少，干細胞特有的組織損傷修復功能使其對角膜損傷修復的治療具有非常獨特的優勢。

干細胞（stem cells）是各種細胞的起源細胞，依靠強大的組織再生能力而成為了再生醫學的重要工具。間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細胞[1]，MSC 具有易獲得、易擴增、低免疫原性和無倫理爭議等優勢，是臨床應用最廣泛的種子細胞之一。MSC 具有調節血管新生的作用，表達促血管新生因子，同時也可以表達抑血管新生因子，當與人的角膜上皮細胞共同培養時，MSC 上調了VEGF 的表達，同時，也表達了抑血管新生因子TSP1，下調了MMP-2 和MMP-9 的表達[2]。MSC 還具有抗瘢痕的作用，通過下調TGF-β 1 和α -平滑肌肌動蛋白（α -SMA）并上調TGF-β 3 來發揮抗瘢痕的作用[3]。

間充質干細胞因子群是干細胞分泌的蛋白產物，干細胞因子具有促修復、調節免疫、抑制瘢痕產生等許多干細胞的生物學特性。經對比試驗證明，干細胞因子的治療效果和干細胞的治療效果相當[4]。同時其使用和保存條件與蛋白類藥物相同，使用和運輸都更加方便和經濟。本文旨在研究間充質干細胞因子群對大鼠角膜化學燒傷的治療作用及進行臨床應用的初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

清潔級健康成年SD 大鼠（購自維通利華），雌雄各半，體重200～220g，24 只。適應性飼養1 周，正常飲食飲水。試驗前，裂隙燈下檢查雙眼附屬器及眼前段，排除眼部病變。

1.2 主要儀器和試劑

裂隙燈顯微鏡、裂隙燈數字圖像處理系統、眼科手術顯微鏡、光學顯微鏡、顯微鏡照相機、石蠟切片機、多媒體醫用彩色圖像病理分析系統等。

戊巴比妥鈉、1mol/L NaOH 溶液、抗生素滴眼液、生理鹽水、2%熒光素鈉等。

1.3 試驗分組

對照組：生理鹽水；治療組：干細胞因子滴眼液（天津百恩生物科技有限公司制）。

1.4 角膜堿燒傷模型制備

采用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。直徑3mm 單層濾紙片浸泡在1mol/L NaOH 溶液中，使之達到飽和狀態，濾紙吸去過多堿液，將其貼敷于角膜中央40s。立即用生理鹽水沖洗燒傷區及結膜囊直至pH=7?；鼗\后正常飼養。

1.5 動物分組及給藥治療

隨機分組，每組造模后24h 開始給藥治療，給藥15 μL/次/眼，3 次/d，使用周期20d，觀察周期21d。

1.6 觀察指標

1.6.1 角膜形態學變化觀察角膜缺損面積，在造模及治療后第1、3、7、10、14、21d，采用2%熒光素鈉染色，于裂隙燈下觀察缺損面積；觀察角膜缺損發生率及角膜穿孔率、前房積血情況。

1.6.2 角膜透明度、水腫程度檢查 造模后第1、3、5、7、10、14、21d，于裂隙燈下觀察角膜透明度、水腫程度。

角膜透明度評分標準[5]：0 分，角膜透明、無混濁；1 分，極輕度角膜淺表混濁，虹膜清晰可見；2 分，輕度角膜基質混濁，可見瞳孔緣及虹膜血管；3 分，中度角膜基質混濁，僅見瞳孔緣；4 分，重度角膜基質混濁，僅見前房；5 分，極重度角膜混濁，前房亦不可見。

角膜水腫程度評分標準：0 分，無水腫（角膜厚度正常）；1 分，輕度水腫（角膜厚度輕度增加）；2 分，中度水腫（角膜厚度中度增加）；3 分，重度水腫（角膜厚度重度增加）。

1.6.3 角膜新生血管（CNV）長度及面積的測量觀察造模后及治療后第1、3、7、14、21d 的CNV 長度及面積。大鼠稱重，經腹腔麻醉（同前法），采用裂隙燈數字圖像處理系統觀察角膜新生血管形成情況，并拍照。照片經圖像分析，通過計算機分析系統測量從角鞏緣向心性生長的連續且彎曲度小，并于角鞏緣切線垂直的新生血管長度。以大鼠角膜9 點到3 點劃一橫線將角膜分成上下兩部分，再由12 點到6 點劃一條線，這兩條線將角膜分成4 個象限。每張圖片在4 個象限測5 個值取其平均值，得出傷后不同時間點大鼠角膜新生血管的長度。帶入電腦數學模型公式計算面積：A=C/12×3.1416[r2-(r-1)2][5]，其中C 為CNV 累計角膜的圓周鐘點數，l 為CNV 從角膜緣伸入角膜的長度，r 為角膜半徑。CNV 總面積等于4 個象限面積之和。

1.7 統計學方法

采用SPSS 11.5 統計學軟件進行處理，測量指標用平均值± 標準差表示，差異顯著性采用重復測量數據分析檢驗，部分資料采用多樣本等級檢驗。

1.8 臨床療效觀察

1）臨床患寵數量：3 只寵物患貓。

2）臨床癥狀：因各種原因引起的角膜損傷或潰瘍，或行瞬膜遮蓋術，無眼部腫瘤，無蛋白過敏史。

3）臨床檢查：患寵淚液常規檢查基本正常；角膜熒光素鈉染色呈陽性，或可見角膜穿孔或潰瘍；或肉眼可見角膜水腫、渾濁，表面大量淺表新生血管形成血管翳、或肉芽組織增生等。

4）治療方法：使用前用生理鹽水沖洗患眼眼表，滴注干細胞因子滴眼液，4 次/d，連續使用；必要時與抗生素滴眼液配合使用。患寵佩戴伊麗莎白圈，防止自主撓傷或舔舐患處。

2 試驗結果

2.1 角膜形態學修復觀察

動物造模后，熒光觀察角膜缺損率100%。試驗各組治療后，均出現不同程度的修復愈合，其中治療組的愈合快于對照組，熒光染色顯示在治療的第7d 可以顯著的觀察到治療組的角膜上皮迅速修復完成，而對照組仍有大面積的缺損，治療組的愈合時間明顯縮短，具有顯著性差異（P＜0.05，圖1）。

從角膜透明度和水腫的臨床評分來看，治療組角膜修復顯著。如圖2 所示，治療組角膜透明度評分與對照組比較，治療的第14、21d 有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 角膜新生血管觀察

圖1 各組不同時期角膜修復熒光染色比較

圖2 各組不同時期角膜水腫度和透明度比較

圖3 各組不同時期角膜新生血管觀察

造模及治療后各組均有不同程度的血管新生情況，其中治療組的新生血管短且粗。隨著治療時間的延長，對照組的新生血管變的又細又長，深入角膜中央，而治療組的大部分角膜新生血管逐漸消失，角膜逐漸透明。治療組的新鮮血管明顯要少于對照組，并具有統計學意義（P＜0.05，圖3）。干細胞因子在加速修復的同時，抑制新生血管的過度生長，從而提高角膜愈合后的透明度。

圖4 病例一患寵使用干細胞因子滴眼液治療前后對比圖

2.3 干細胞因子在寵物眼科臨床治療觀察

病例一為1 歲公貓，因角膜外觀異常來院就診。臨床檢查可見威脅反應正常，淚液量正常，熒光素染色陽性，可見角膜穿孔，纖維素樣物滲出，未見眼內翻及異位睫毛等異常。因畜主拒絕手術治療，遂單純使用藥物治療。給予干細胞因子滴眼液治療，同時配合抗生素滴眼液，4 次/d，逐日使用。結果顯示，干細胞因子滴眼液治療3 周后患寵角膜穿孔愈合（圖4）。

病例二患貓，不明原因角膜潰瘍在外院接受治療，未見好轉，后轉院。檢查可見熒光素染色陽性，角膜潰瘍，行瞬膜遮蓋術，術后1 月拆線。拆線后見角膜水腫及表面肉芽組織增生，并出現眼瞼內翻。行眼瞼內翻矯正術后使用干細胞因子滴眼液修復角膜，4 次/d，連用3d。結果顯示，干細胞因子滴眼液治療3d 后，角膜水腫明顯改善，角膜透明度恢復，表面肉芽組織消失（圖5）。

圖5 病例二患寵使用干細胞因子滴眼液治療前后對比圖

病例三布偶貓，因左眼結膜炎就診，經口服藥物和常規滴眼液配合治療一月，期間角膜緣出現明顯血管化，密度逐漸升高并向視軸區蔓延，持續惡化。檢查可見淚量檢查正常，熒光素染色和細胞學檢查因客觀原因未進行，可見明顯角膜表面大量淺表新生血管形成血管翳，無眼瞼內翻、雙行睫等。診斷為結膜炎誘發慢性角膜炎，并發血管翳，角膜潰瘍及嗜酸性角膜炎待排查。隨后給予患眼干細胞因子滴眼液，4 次/d，逐日使用。結果顯示，使用干細胞因子滴眼液治療4d 后，患眼角膜透明度增加，血管翳基本消失（圖6）。

3 討論

圖6 病例三患寵使用干細胞因子滴眼液治療前后對比圖

角膜損傷修復是一個復雜的、多種細胞因子協同、多種細胞參與的過程。角膜不同程度的損傷其愈合過程需要不同細胞及細胞因子的參與[6]，上皮細胞可在表皮生長因子（EGF）等細胞因子的激活作用下快速進行增殖，并由邊緣向損傷區域遷移，從而完成對損傷區域的填補和修復，恢復角膜上皮的完整性。當上皮損傷范圍較大且嚴重時，角膜緣干細胞的參與變得不可或缺（圖7），是角膜組織再生能力的重要保障。損傷發生后其在胰島素樣生長因子（IGF）、轉化生長因子β（TGF-β ）等細胞因子的作用下被激活，開始增殖并產生瞬時擴增上皮細胞，瞬時擴增上皮細胞最終分化為成熟的上皮細胞并不斷從角膜緣基底層向角膜表層和角膜中央遷移，這個過程將使得角膜的傷口逐漸縮小直至閉合。

圖7 干細胞因子治療角膜損傷機制示意圖

基質層中的角細胞在肝細胞生長因子（HGF）、TGF-β、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等因子的刺激下啟動向成纖維細胞的轉化。激活后的成纖維細胞對細胞外基質進行重構，進而完成對基質層傷口的填充和閉合。

角膜內皮細胞不具有再生能力，當角膜內皮損傷時，內皮細胞可在TGF-β 等細胞因子的作用下完成“上皮-間充質轉化”，內皮細胞發生延展遷移從而完成對傷口的閉合。

研究發現，MSC 可以分化成多種類型細胞，例如，脂肪細胞、骨細胞、成骨細胞[7]，同時它也能轉分化成為其他胚層的細胞，例如神經細胞，心肌細胞等[8]；有研究報道MSC 可以分化成角膜上皮細胞，表達角膜上皮細胞標記的CK3，進而參與角膜上皮的損傷修復[9]；MSC 也可以遷移至角膜基質中，分化成除上皮細胞以外的其它類的細胞[10]。

眾多研究發現，MSC 的治療作用更多是通過旁分泌作用來實現的，而不是直接分化。MSC 通過分泌一系列促進組織損傷修復的因子[11-14]，例如血小板來源生長因子（PDGF）、bFGF、TGF、HGF、EGF 等來促進角膜上皮的增殖和遷移，進而促進角膜上皮的再上皮化。MSC 還具有抗炎作用，它通過分泌抗炎因子（例如IL-10、TSG-6）和抑制促炎因子（例如IL-1a、IL-6、IL-17、IFN-g、G-CSF、GM-CSF、MIP-2a、MCP-1）來發揮抗炎作用[15]。動物試驗數據表明，移植含有MSC 的羊膜到化學燒傷模型動物的角膜上，移植4周后，角膜中炎性因子IL-2、MMP2 的表達是被抑制的，而抑制炎癥防止了角膜的進一步損傷[16]。其他研究團隊也發現將MSC 移植到角膜可以抑制炎性因子IL-2 和干擾素（IFN-γ ）的表達，提高了抑炎因子IL-10、轉化生長因子（TGF-β 1）的表達[2]。

4 結束語

綜上所述，角膜各層的修復均有賴于各種細胞的參與，而細胞的參與則必須經過多種細胞因子的激活和調節。細胞因子在細胞增殖再生及組織修復中的重要作用恰恰是近年來生物醫學的重要成果，諸如EGF、bFGF 等作為有效成分的單因子藥物已應用于眼科臨床多年。間充質干細胞因子群是MSC 分泌的蛋白產物，富集多種細胞因子，集合了干細胞的促修復、調節免疫、抑制瘢痕產生等許多生物學特性（表1）。試驗藥效學及臨床應用顯示，間充質干細胞因子群可以參與角膜各層的細胞修復，進而促進角膜愈合，同時抑制瘢痕的生成。

表1 干細胞因子的生物學效應