一起肉雞雞毒支原體感染的檢測與分析

李熙，張古月，龍劍，李潤成

（1.長沙市農業綜合行政執法局長沙 410013;2.湖南農業大學動物醫學院長沙 410128）

雞毒支原體（Mycoplasma Galliscepticum，MG）是危害養雞業的重要病原，在雞群具有較高的感染率[1-2]，我國雞群感染陽性率可達到50%～80%[3]。雞在4～8 周齡時對該病原最為敏感[4]。2019 年9 月，邵陽某雞場一批50 日齡左右的雞，6,000 羽左右，地面飼養，白天室外放養，晚上關入雞舍。一天早晨突然發現死亡40 多羽，根據臨床情況懷疑MG、副禽嗜血桿菌、大腸桿菌3 種病原中的一種或幾種混合感染，采集病料樣本進行了實驗室的檢測分析，并采取針對性防控措施控制了疫情，現報告如下：

1 材料

1.1 病料：雞鼻竇黏液、喉氣管及肝臟樣本。

1.2 主要試劑：DNA 提取試劑盒（柱式病毒DNAout）、PCR 酶mix3.0，購于北京天恩澤生物科技有限公司；巧克力營養瓊脂購自貝瑞特生物技術(鄭州)有限責任公司。

2 方法

2.1 病雞的臨床、解剖觀察

首先對發病雞群進行臨床觀察，然后取3 只臨床表現具有代表性的雞，按常規方法進行解剖觀察并記錄。

2.2 細菌分離鑒定

用無菌接種環鉤取鼻竇分泌物、肝臟樣本，分別劃線接種至巧克力營養瓊脂，37 ℃溫箱中培養36 h，觀察細菌生長情況，如有優勢菌落生長則進行進一步的細菌純培養鑒定。

2.3 病毒檢測

按照DNA 提取試劑盒說明書提取解剖雞鼻竇、喉氣管分泌物基因組DNA，然后用參照文獻[5]合成的雞毒支原體檢測引物，以提取的基因組做為模板，進行PCR 檢測。PCR 體系為：PCR Mix 25 μL、純水21 μL、上游引物1μL、下游引物1 μL、模板2 μL。PCR 退火溫度為50℃，PCR 完畢后進行產物的電泳鑒定，并將陽性產物送北京擎科生物技術有限公司進行序列測定。

2.4 防控

根據臨床觀察結果擬定初步方案進行防控，待實驗室檢測結果明確后再考慮是否需要制定新的防控措施。

3 結果

3.1 臨床解剖觀察結果

臨床觀察發病雞群，有少量雞存在一側或兩側眼睛流淚或充滿干酪樣滲出物，失明（圖1、2），但未發現明顯甩頭和呼吸異常。擠壓死亡病雞鼻孔可見大量黏液流出（圖3），喉部有干酪樣滲出物、氣管內充滿黏液（圖4），其它病變不明顯；單側眼睛失明但尚未死亡的病雞，發現除眼睛出現上述問題、鼻竇充滿黏液外（圖5），氣管以及其它臟器均無明顯病變。

圖1、眼睛流淚

圖2、眼睛充滿干酪樣物質

圖3、鼻孔有黏液擠出

圖4、氣管內布滿黏液

圖5、鼻竇充滿黏液

3.2 細菌分離鑒定

無菌操作取眼睛分泌物、鼻竇黏液劃線接種巧克力營養瓊脂，37℃培養48 小時。結果眼睛分泌物接種的培養基上僅長出幾個大小不一的菌落，未分離到大量直徑較大、灰白色、類似于大腸桿菌的菌落；鼻竇黏液接種的培養基上，除長出一些大小、形態不一的菌落外，無菌落形態一致的優勢細菌生長，未見到小而半透明，針尖狀，類似副雞嗜血桿菌的小菌落[6]。

3.3 雞毒支原體的PCR 檢測

取鼻竇及氣管分泌物提取DNA 基因組，并以提取的基因組為模板，采用參照文獻[5]合成的MG 檢測引物進行PCR 擴增，結果從3 個樣本均擴增出了預期大小的特異性條帶（圖6）。

將陽性PCR 產物送北京擎科生物技術有限公司進行序列測定。結果來自3 個樣本的序列同源性為100%，將其中1 個樣本測出序列上傳至GenBank，登錄號為MN526743。該序列與Gen-Bank 登錄的其它MG 菌株相應片段同源性見圖7。由圖可見從病料樣本中測出的MG 脂蛋白序列與2016 年提交，來自中國病雞肺臟的菌株QHDT-1（登錄號：KY088075）具有100%的同源性。

圖6、雞毒支原體PCR 檢測結果

圖7、雞毒支原體同源性比較圖

3.4 防控

首先根據臨床初步診斷結果，采用對MG、副雞嗜血感染、大腸桿菌均有效的廣譜抗生素多西環素，飲水添加飼喂，同時適當降低雞群密度，3d 后，沒有再出現死亡病例，也未見到眼睛失明病雞數量的增加，但眼睛已失明的雞未康復。實驗室檢測結果證明無明顯副雞嗜血桿菌和大腸桿菌感染后，再改用對支原體有特效的泰萬菌素飼喂4d。除已出現眼睛失明的病雞外，沒有再發現雞群中出現類似異常情況。

4 討論與分析

本文對一規模雞場雞群突然出現死亡、少量雞只眼睛流淚、一側眼睛失明的病例進行了臨床和實驗室檢測。結果從眼睛分泌物僅培養出幾個形態不一的菌落，表明樣本中沒有大量可生長于巧克力營養瓊脂的細菌存在，說明該病例可能并非大腸桿菌引起的全眼球炎；從鼻竇黏液沒有培養出形態一致，數量上具有優勢的菌落，更未發現類似副雞嗜血桿菌的菌落，同樣可以排除副雞嗜血桿菌引起的雞傳染性鼻炎。但從氣管分泌物均檢測到MG，可以推斷該次雞群出現發病應該主要是由MG 感染引起。結合臨床使用主要針對支原體的藥物，很快控制了疫情，進一步證明該次雞群發病的主要原因。此外，測定的脂蛋白基因序列比對結果表明，樣本中MG 與來自中國病雞肺臟，2016 年提交至GenBank 的菌株QHDT-1 具有100%的同源性，該毒株在我國雞群是否屬于一個流行較廣的毒株尚需進一步調查。

MG 除可通過雞蛋傳播[7]外，上呼吸道和黏膜是其自然感染的通道。其主要寄生在雞的呼吸道和結膜表面，上呼吸道和結膜是氣溶膠和飛沫中菌株進入機體的通道，免疫抑制和較差的環境條件或其他應激因素可能有助于誘發嚴重的MG 疾病[8]。因此雞場做好飼養管理，提高雞群健康水平，并且適當降低雞群密度，在做好防寒工作的同時，盡量減少雞舍空氣中可傷害上呼吸道黏膜的氨氣、硫化氫，以及可攜帶MG 的飛沫，對于MG 的防控具有非常重要的作用。此外，雞MG 可產生耐藥性[8]，有條件的雞場可以考慮進行藥物敏感性檢測，選用敏感藥物進行防控，如果未進行藥物敏感性檢測則建議選用2—3 種敏感藥物輪換使用，以防MG 的耐藥性影響疾病防控效果。