褐藻膠寡糖對D-半乳糖誘導小鼠骨質疏松的作用

(青島大學附屬醫院老年醫學科，山東 青島 266100)

骨質疏松具有骨微觀結構退行性改變、骨量減少和骨密度降低的特點，導致骨強度降低[1]、骨脆性增加[2]及骨折風險增加[3]，引起了老齡化社會的廣泛關注。氧化應激學說是衰老的重要機制之一[4]，該學說認為活性氧(ROS)的積聚超過機體的清除能力造成DNA損傷、激活氧化應激，從而導致衰老及衰老相關疾病的發生。ROS在體內積聚可激活核因子κB受體活化因子配體(RANKL)信號通路，導致骨吸收增加。RANKL信號通路被認為是促進破骨細胞活化的主要靶點，可激活多種下游信號通路[5]，從而促進骨吸收和破骨細胞分化過程。長期注射D-半乳糖(D-gal)可導致實驗動物產生一系列類似于自然老化的病理變化，如認知障礙、氧化應激和骨量減少等[6]。用D-gal誘導建立亞急性衰老模型具有周期短、價格低廉、操作簡便、結果穩定可靠等優點，已廣泛應用于衰老機制研究和抗衰老藥物篩選。褐藻膠寡糖(AOS)具有較高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等[7]。骨質疏松性骨折是導致老年人死亡的主要原因之一[8]，因此骨質疏松癥的早期預防、診斷和治療十分重要，開發更有效的延緩骨質疏松癥的藥物具有重要意義。目前大多數骨質疏松研究側重于絕經后婦女，而缺乏對老年男性骨質疏松的研究。故本實驗采用D-gal誘導建立小鼠骨質疏松模型，探討AOS對衰老雄性小鼠骨質疏松的作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康雄性C57BL/6J小鼠45只，SPF級，8周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養于青島大學醫學部SPF級實驗動物中心。飼養條件：12 h晝夜循環，室溫(20±2)℃，相對濕度40%～60%，自由攝食物和水。動物實驗操作均經青島大學動物福利和倫理管理委員會批準，并且遵守中國動物保護委員會制訂的《動物保護與使用指南》。P16小鼠單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司，逆轉錄試劑盒及Mix購自Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 45只小鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組(Control組，A組)、模型組(D-gal組，B組)、D-gal+AOS低劑量組(D-gal+AOS-L組，C組)、D-gal+AOS中劑量組(D-gal+AOS-M組，D組)以及D-gal+AOS高劑量組(D-gal+AOS-H組，E組)，每組9只。Control組小鼠頸背部皮下注射滅菌注射用水5 mL/(kg·d)，其余組小鼠頸背部皮下注射D-gal 200 mg/(kg·d)，連續8周。從D-gal注射第5周開始，AOS干預低、中、高劑量組分別給予AOS 50、100、150 mg/(kg·d)灌胃處理4周，Control組和D-gal組小鼠給予蒸餾水10 mL/(kg·d)灌胃處理4周。

1.2.2骨密度測量 藥物干預完成后，取每組各3只小鼠的同側股骨，采用雙能X線骨密度儀(Dexa；Osteosys Primus，Korea)對整個股骨進行骨密度測量(掃描間距1.5 mm，掃描速度60 mm/s)。

1.2.3Western Blot檢測P16和P67 phox蛋白表達 藥物干預完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進行液氮研磨，將RIPA裂解液加入研磨好的股骨組織中提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。提取的蛋白進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍至分離膠底部時轉移到PVDF膜上，凝膠成像系統成像后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.4RT-PCR檢測股骨組織p47phox、gp91phox和RANKLmRNA的表達 藥物干預完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進行液氮研磨，加Trizol 50～100 g/L，顛倒混勻室溫放置30 min。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，加1/5體積氯仿，充分震蕩混勻后置于冰上靜置5 min。4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清轉移至新的1.5 mL EP管中。加入與上清等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，置于冰上靜置10 min。4 ℃下以12 000 r/min離心10min，棄上清，加體積分數0.75的乙醇溶液懸浮沉淀。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，吸除上清，自然晾干后加入10 μL DEPC水溶解RNA。用Nanodrop分光光度計測定RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA。應用RT-PCR法進行擴增，擴增條件：95 ℃、600 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共計40個循環；95 ℃、10 s，65 ℃、60 s,97 ℃、1 s。PCR引物及其序列見表1。

1.3 統計學方法

表1 PCR引物及其序列

2 結 果

2.1 各組小鼠股骨骨密度比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨骨密度明顯下降；與D-gal組相比較，AOS干預各組小鼠股骨骨密度明顯增加，差異均有統計學意義(F=46.853，P<0.05)。見表2。

2.2 各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達增加；與D-gal組比較，AOS干預各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達降低，差異均有統計學意義(F=50.862、156.943，P<0.05)。見圖1、表2。

A：Control組，B：D-gal組，C：D-gal+AOS-L組，D：D-gal+AOS-M組，E：D-gal+AOS-H組。

圖1 各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達的Wes-tern Blot檢測

組別骨密度P16P67 phoxA組0.670±0.0101.000±0.0001.000±0.000B組0.423±0.0381.503±0.0921.917±0.081C組0.620±0.0101.415±0.0501.043±0.095D組0.677±0.0491.063±0.0130.753±0.071E組0.717±0.0150.567±0.0150.573±0.070

2.3 各組小鼠股骨組織中p47 phox、gp91 phox 和RANKL mRNA表達比較

與Control組相比較，D-gal組股骨組織中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表達增加；與D-gal組相比，AOS干預各組小鼠股骨組織中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表達降低，差異均有統計學意義(F=17.373～112.311，P<0.05)。見表3。

組別p47 phoxgp91 phoxRANKLA組1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000B組2.503±0.1401.804±0.0617.962±0.609C組1.643±0.0871.378±0.2764.135±1.225D組1.138±0.0951.183±0.1631.681±0.172E組0.804±0.1610.848±0.1111.092±0.075

3 討 論

到2050年，65歲以上的老年人口將超過8億。隨著世界人口平均壽命的延長，衰老相關疾病如阿爾茨海默病[9]、骨質疏松[10]等的發病率和死亡率將明顯增加，其造成的社會醫療負擔也日益加重。骨質疏松癥是一種與年齡相關的退行性疾病，嚴重影響人們的生活質量，導致老年人的死亡率增加。衰老可以引起骨皮質和骨小梁的礦化減少、孔隙度增加及骨密度降低等，導致骨質疏松和骨折的風險增加[11]。本文研究結果顯示，D-gal組衰老性骨質疏松模型小鼠的股骨骨密度較Control組顯著降低，而與D-gal組相比，AOS干預各組小鼠的股骨骨密度顯著增加。說明AOS對D-gal誘導的骨質疏松有保護作用。P16作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子[12]，在衰老和抑制腫瘤生長過程中起重要作用。P16在大多數嚙齒動物和人體組織中的表達隨年齡增長而顯著增加[13]。本文結果顯示，P16蛋白在D-gal組股骨中的表達增加，而與D-gal組相比，AOS干預各組小鼠股骨中P16蛋白的表達降低，說明AOS延緩了D-gal誘導的衰老進程。

氧化應激可誘導DNA損傷和細胞衰老，而抑制衰老可能是治療骨丟失的有效方法。氧化應激與許多年齡相關疾病(骨質疏松、心血管疾病和神經退行性疾病等)有關，它可以破壞骨骼系統中骨吸收和骨形成的動態平衡，使骨硬度和強度降低，在骨質疏松的發生和發展中起重要作用[14]。ROS的一個主要來源是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，它可促進氧化應激的發生。本研究結果顯示，D-gal組股骨中NADPH氧化酶亞基p67phox、p47phox和gp91phox的mRNA表達增加，而與D-gal組相比，AOS干預各組股骨中NADPH氧化酶亞基mRNA表達減少。表明AOS對衰老性骨質疏松的保護作用可能與氧化應激的抑制有關。

隨著年齡的增長，破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨生成之間失去平衡[15]，當骨吸收超過骨形成時出現骨代謝失衡，引起骨量降低從而導致骨質疏松的發生。RANKL在破骨細胞生成中發揮著重要的作用[16]，可以與核因子κB受體活化因子(RANK)結合激活信號通路，促進破骨細胞活化、分化和成熟等過程[17]。RANKL相關信號通路被認為是促進骨丟失和破骨細胞活化的主要靶點[18]。本研究結果顯示，在衰老性骨質疏松D-gal組股骨中RANKLmRNA表達增加，而與D-gal組相比，AOS干預各組小鼠股骨中RANKLmRNA表達降低，說明AOS對衰老性骨質疏松的保護作用可能與RANKL通路抑制有關。

綜上所述，AOS對D-gal誘導的C57BL/6J小鼠骨質疏松有保護作用，其機制可能與氧化應激和破骨細胞活化抑制有關，具體機制還需進一步研究。