食管鱗癌組織中lncRNA UCA1表達及其對癌細胞黏附和遷移影響

(1 河南科技大學臨床醫學院(河南科技大學第一附屬醫院)胸外科,河南 洛陽 471000； 2 安陽市人民醫院胸外科)

食管癌發病是由多種因素共同作用的結果，隨著基因高通量測序技術的發展，長鏈非編碼RNA(lncRNA)被認為在多種癌癥發展中扮演重要角色[1-2]。已有研究結果表明，lncRNA參與人體細胞增殖、分化、轉移、凋亡等生物學活動，其在多種惡性腫瘤發展中也發揮作用[3-6]。尿路上皮癌相關基因1(UCA1)是癌癥調節耐藥基因，參與多種腫瘤的惡性發展[7-12]，如胃癌、肺癌、直腸癌等。UCA1是一種來源于人類內源性逆轉錄病毒(HERV-H)家族的lncRNA分子，其基因定位于人類第19號染色體(19p13.12)，全長為1.4 kb。lncRNAUCA1最初在膀胱癌被發現，并能夠促進腫瘤細胞增殖和轉移[13]。目前，lncRNAUCA1在食管癌中表達及其作用研究報道較少。本文對lncRNAUCA1在食管鱗癌中表達及其對癌細胞黏附和遷移的調控進行分析，探討lncRNAUCA1用于食管鱗癌病人早期診斷及術后監測的臨床價值。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手術治療的52例食管鱗癌病人作為研究對象，男性28例，女性24例，年齡48～72歲，平均(62.8±7.6)歲。納入標準：所有病人均經術后組織病理檢查證實為食管鱗癌，手術前均未給予化療及放療處理。排除標準：肝腎功能異常、免疫缺陷、其他惡性腫瘤，以及并發高血壓、糖尿病等全身系統疾病者。該組病人均自愿接受手術，對本次研究均知情同意。本研究經過我院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器和試劑

1.2.1主要儀器 全自動組織包埋機(日本櫻花集團)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；實時熒光定量PCR(qRCR)儀(CFX96型，美國Bio-Rad公司)；Eppendorf Research移液器(德國Eppendorf公司)；臺式低溫超速離心機(德國Eppendorf公司)；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)等。

1.2.2主要試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶(中國)公司)，Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection kit(美國Gene Copoeia公司)，PCR擴增引物、DEPC水(生工生物工程(上海)技術有限公司)，氯仿、異丙醇、無水乙醇(中國國藥集團)，胎牛血清(德國PAN公司)，2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素注射液(新賽美生物科技有限公司)，人食管鱗癌細胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13(上海弘順生物科技有限公司)，質粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1(上海吉凱基因化學技術有限公司合成)。

1.3 實驗方法

1.3.1標本獲取及處理 取病人原發灶處部分癌組織及距離原發灶邊緣3～5 cm正常組織。標本切除后立即分為兩部分：一部分在新鮮狀態下用RNA保存液保存以提取RNA；另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蠟塊保存，用于HE染色。

1.3.2lncRNAUCA1表達的qPCR檢測 Trizol法提取總RNA，采用qPCR兩步法進行檢測。設計lncRNAUCA1引物，然后使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，配制qPCR反應體系，設置反應程序(95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)進行qPCR擴增。通過軟件得到Ct值，單位為HU。

1.3.3食管癌細胞遷移和侵襲實驗 采用劃痕試驗和Transwell侵襲實驗分別檢測UCA1基因對食管癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響。構建表達載體并提取重組質粒，對重組質粒si-UCA1/pc-DNAUCA1進行鑒定，隨后進行大量的提取和純化，測定其濃度和純度，保存備用。將重組質粒進行轉染，轉染后提取RNA進行熒光定量驗證轉染效率。以腫瘤細胞膜著色判斷為陽性，根據陽性細胞數及陽性細胞染色強度判斷基因表達結果，其中≥3+為過表達，<3+為低表達。按操作說明進行劃痕試驗，在倒置顯微鏡下觀察劃痕后0、12、24 h的劃痕間距，計算細胞遷移率。根據操作說明進行Transwell侵襲實驗，計數透過人工基底膜的細胞數。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 癌組織和癌細胞UCA1表達

食管鱗癌組織和癌旁組織的HE染色見圖1。qPCR結果表明，原發灶癌組織中UCA1的Ct值為(1.52±0.56) HU，癌旁組織為(0.95±0.36) HU，兩者比較差異有顯著意義(t=6.174，P<0.01)。UCA1在人食管癌細胞系中的相對表達量分別為：Eca109(0.61±0.08)、KYSE170(0.52±0.11)、KYSE150(0.31±0.05)、KYSE9706(0.29±0.19)、KYSE30(0.28±0.18)、TE1(0.21±0.11)和TE13(0.22±0.12)，均明顯高于正常食管上皮細胞NE1(0.07±0.03)，差異具有統計學意義(F=107.26，P<0.01)。并且Eca109、KYSE170細胞中UCA1表達相對較高，而在TE1和TE13細胞中UCA1的表達較其他細胞系低。因此，選擇代表性的食管癌細胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13進行后續相關的研究。

2.2 UCA1表達對食管癌細胞遷移影響

在12和24 h細胞的劃痕間距百分比結果表明，與Eca109及KYSE170細胞比較，過表達UCA1基因明顯抑制食管癌細胞系TE1和TE13遷移能力，差異有統計學意義(F=187.38～243.88，P<0.01)；與TE1和TE13細胞比較，低表達UCA1基因能夠明顯促進食管癌細胞系Eca109和KYSE170的遷移能力，差異也有統計學意義(F=133.00～1 252.32，P<0.01)。見表1。

UCA1基因時間(t/h)Eca109KYSE170TE1TE13過表達1275.78±8.1877.42±5.2867.42±2.7850.23±8.342458.54±4.2153.42±6.2843.58±3.7835.21±4.52低表達1263.38±4.5661.32±4.4244.28±2.6844.32±10.062456.32±4.3642.05±3.2520.75±3.9315.98±3.72

注：UCA1基因過表達細胞12 h遷移能力比較，F=187.38，P<0.01；UCA1基因過表達細胞24 h遷移能力比較，F=243.88，P<0.01；UCA1基因低表達細胞12 h遷移能力比較，F=133.00，P<0.01；UCA1基因低表達細胞24 h遷移能力比較，F=1 252.32，P<0.01。

2.3 UCA1表達對食管癌細胞侵襲影響

UCA1過表達的TE1和TE13細胞能夠透過人工基底膜的數量明顯高于Eca109和KYSE170，差異有統計學意義(F=1 388.68，P<0.01)。提示UCA1基因的過度表達顯著促進了TE1和TE13食管癌細胞系的侵襲性。UCA1低表達的Eca109和KYSE170細胞透過人工基底膜的數量明顯低于TE1和TE13，差異有統計學意義(F=426.20，P<0.01)。提示UCA1基因的低表達顯著抑制了食管癌細胞系Eca109和KYSE170的侵襲性。見表2。

UCA1基因Eca109KYSE170TE1TE13過表達267.21±11.90291.24±19.13434.52±13.28393.65±16.74低表達224.72±17.06208.68±24.12301.18±11.63309.06±17.02

注：過表達組侵襲能力比較，F=1 388.68，P<0.01；低表達組侵襲能力比較，F=426.22，P<0.01。

3 討 論

lncRNAs能夠在表觀遺傳學、轉錄調控和轉錄后調控等不同水平上調控基因表達。國外的研究結果顯示，lncRNAs的異常表達在各種惡性腫瘤的發生過程中起著重要作用[14-17]。腫瘤的發生是原癌基因激活、抑癌基因失活和細胞的永生化等過程所致，正常細胞有完善調控系統使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs處于動態平衡，而在腫瘤細胞中這種平衡被打破。研究顯示，UCA1在多種腫瘤的發生中發揮作用，如胃癌、胰腺癌和宮頸癌等[18-21]。

本文對UCA1在食管鱗癌中的表達水平及其對腫瘤細胞的遷移、黏附調控作用進行探討。qPCR結果表明，原發灶癌組織中UCA1的Ct值明顯高于癌旁非腫瘤組織，說明腫瘤組織中的UCA1表達水平明顯升高，這與已有報道結果相符[22-24]。說明UCA1與食管癌的發生有一定關系，提示UCA1有可能作為食管癌的腫瘤標志物。

腫瘤細胞發生侵襲和轉移涉及細胞外基質的降解和上皮細胞-間充質轉化(EMT)，細胞間黏附破壞對上皮可塑性的維持非常重要，該過程由鈣黏蛋白介導，這已被證實是癌癥的最初事件[25]。在腫瘤的發展過程中，細胞黏附破壞是一個重要的侵襲和轉移事件。本文對UCA1表達在食管鱗癌細胞侵襲和遷移中的影響進行觀察，研究結果顯示，低表達UCA1可抑制Eca109和KYSE170細胞遷移能力，過表達UCA1促進了TE1和TE13細胞遷移能力；低表達UCA1抑制了Eca109和KYSE170細胞的侵襲能力，過表達UCA1促進了TE1和TE13細胞侵襲能力。這表明過表達的UCA1可以促進食管鱗癌細胞的遷移、侵襲能力，反之，干擾UCA1則起到相反的作用。國外通過流式細胞術分析顯示，低表達UCA1基因可以上調EMT相關轉錄因子E-cadherin的表達，下調N-cadherin、Snail和Vimentin的表達，抑制食管癌細胞的遷移和侵襲能力；過表達UCA1基因可以下調EMT相關轉錄因子E-cadherin的表達，上調N-cadherin、Snail和Vimentin的表達，促進食管癌細胞的遷移和侵襲能力[26]。

綜上所述，lncRNAUCA1在食管鱗癌呈高表達水平，促進食管癌細胞侵襲和遷移能力，抑制了食管癌細胞凋亡。本研究同時也證實，血清lncRNAUCA1可作為食管鱗癌病人診斷的新型潛在的循環腫瘤標志物，值得臨床推廣應用。