蓖麻肌動蛋白基因的克隆、抗體制備和表達分析

王 芳,湯璧蔚,董 樂,劉 寶,2,黃 慧,黃蘋蘋,張立群,欒芙蓉

(1.泉州師范學院 海洋與食品學院,福建 泉州 362000；2.東北師范大學 分子表觀遺傳學教育部重點實驗室,吉林 長春 130024)

基因表達分析是功能基因組學研究的主要實驗方法,可用于評價生物體復雜的基因調控網絡,且理解基因表達模式還有望揭示與理想性狀產生相關的新基因[1]。基因表達是從DNA到蛋白質的過程,包括遺傳信息的轉錄和翻譯。基因表達受轉錄水平和轉錄后水平等不同層次的調控。因此,從轉錄水平和轉錄后水平等不同層次對基因表達進行分析,才能更全面系統地理解高等生物中基因的表達模式。目前,基因表達能力強弱的評價一般用mRNA相對表達量和/或蛋白質相對表達量作為指標。實時熒光定量PCR(qPCR)具有重現性、特異性、靈敏性、簡單性、低成本和高通量的特點,因此,成為在mRNA水平對基因表達進行絕對和相對定量的最新興工具[2-3]。蛋白質印跡法(Western Blot)因具有高特異性、高精確度、高可靠性、高靈敏度的特點,成為一種可以用來精確量化相對蛋白質水平的有效且必不可少的技術[4]。qPCR和Western Blot結果的準確性取決于對實驗技術和策略運用的恰當與否[4-5]。qPCR結果的準確性受RNA的完整性、逆轉錄效率、擴增效率和cDNA的質量等因素影響[6]。Western Blot結果的準確性受樣品制備是否恰當、和感興趣樣品相關的蛋白質染色與抗體之間的線性范圍是否確定、第一抗體的質量是否可靠、信號是否過飽和及目標蛋白信號強度量化是否準確等因素的影響[4]。準確評價目的基因的表達水平除需要一個標準化的程序外[4, 7],還需對數據進行標準化處理,以減小樣品本身和實驗系統對定量結果的影響。內參基因的使用是最有效并且可能是整個研究中最容易糾正錯誤的方法之一[5]。

內參基因的選擇應根據一些標準進行優化后確定[8],理想的內參基因應在所有的細胞中或在各種生理狀態下均能穩定地表達[9],不受實驗過程的影響,或者不會隨目標基因一同被調控[10]。最常用的內參基因是管家基因(House-keeping genes, HKGs),因為不管是在正常的還是在病理生理條件下,它們均能夠在生物體的所有細胞中表達[11]。HKGs是維持諸如細胞分裂、生長發育、凋亡、生理過程(如糖酵解)及代謝等基本細胞功能所必需的組成型表達基因[11]。最廣泛和傳統的作為內參基因的HKGs包括：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、延伸因子(Elongation factor-1α,EF-1α)、泛素蛋白基因(Polyubiquitin,UBQ)、肌動蛋白基因(Actin)、α-微管蛋白基因(α-tubulin)、β-微管蛋白基因(β-tubulin)、18S rRNA基因(18SrRNA)、25SrRNA基因(25SrRNA)、泛素結合酶基因E2(Ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)、真核起始因子基因(Eukaryotic initiation factor 1,EIF1)、真核轉錄因子基因(Eukaryotic transcription factors, ETF)等[7]。除了HKGs之外,一些功能未知且與管家功能無關的基因也因其穩定表達的特性而被用于數據的標準化[12]。

近來研究發現,內參基因表達的穩定性可能也會受到對細胞有作用的非生物、生物和發育因素的影響,即使使用相同的試驗生物,一個試驗所用的內參基因也可能不適合另一個試驗[11]。一些管家基因的表達量在同一植株的不同器官中也會呈現變化[11]。因此,對于基因表達分析而言,確定內參基因的可靠性是至關重要的[13]。

Actin廣泛存在于高等植物的各種組織細胞中,如花粉、莖韌皮部、葉表皮細胞、葉鞘細胞、根毛、卷須等,對維持高等植物正常的生長發育起著重要的作用[14]。在基因表達研究中,無論是在生物的還是在非生物的脅迫條件下,Actin基因過去經常被用作內參基因[11]。但新近研究表明,Actin有時也會受到生理狀態或者環境的調控而呈現出表達水平的差異[15]。如在寒冷、干旱、鹽害和氧化脅迫條件下,甘薯(Ipomoeabatatas(L.) Lam)Actin的表達量在不同品種中并不穩定[16]；棉花(GossypiumhirsutumL.)Actin14在NaCl脅迫時僅在葉中穩定表達[17]。因此,在采用Actin作為內參基因開展試驗研究時,必須首先評價其在不同生長條件下在所研究物種中表達的穩定性。

蓖麻(RicinuscommunisL.)系大戟科(Euphorbiaceae)蓖麻屬(RicinusL.),為世界十大油料作物之一。蓖麻Actin基因(RcActin)全長cDNA序列已被提交GenBank(登錄號：XM_002522148.3),但其組織表達模式在轉錄和翻譯水平上的研究尚未見報道。

本研究采用RT-PCR技術克隆RcActin的編碼序列(Coding sequence, CDS),構建原核表達載體pET32a(+)-RcActin并進行表達,產生融合蛋白His-RcActin,用純化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,制備抗RcActin的單克隆抗體(Anti-RcActin monoclonal antibody, anti-RcActin McAb),利用anti-RcActin McAb,通過RT-qPCR和Western Blot方法,分析在不同濃度NaCl脅迫下RcActin在盆栽蓖麻生長根、一次分枝老葉、一次分枝新生葉、一次分枝雌花、一次分枝雄花、主莖、主莖果實和一次分枝果實共8種組織中的表達模式,以探討RcActin基因在蓖麻功能基因表達研究中作為內參基因的可行性,為蓖麻的基因表達研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蓖麻種子由內蒙古通遼市農業科學研究院惠贈。SP2/0小鼠骨髓瘤細胞由大連醫科大學麻彤輝教授惠贈。BALB/c雌性小鼠購自吳氏實驗動物(福州)。

大腸桿菌(E.coli)感受態菌株DH5α和BL21(DE3)(天根生化科技有限公司,北京)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗鼠IgG(天根生化科技有限公司,北京)、MinuteTMTotal Protein Extraction Kit(Invent Biotechnologies,北京)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(Beyotime,上海)、TRIzolTMReagent(Invitrogen,美國)、TaqDNA聚合酶(Invitrogen,美國)、Reverse Transcription System(Promega,北京)、Oligotex? mRNA Mini Kit(Qiagen,美國)、QIAquick? PCR Purification Kit(Qiagen,美國)、QIAquick? Gel Extraction Kit(Qiagen,美國)、QIAprep? Spin Miniprep Kit(Qiagen,美國)、BeaverBeadsTMHis-tag Protein Purification(BeaverBeads,蘇州)、NAbTMProtein A/G Spin Kit(Thermo Scientific,美國)、SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒(Southern Biotechnology,美國)、鼠抗His單克隆抗體(Biomiga,美國)、WesternBrightTMECL(Advansta,美國)、Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix(Agilent,美國)、BamH Ⅰ(Neb,美國)、XhoⅠ(Neb,美國)、T4DNA連接酶(Neb,美國)、DNA分子量標準(Neb,美國)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG)(Promega,北京)、蛋白分子量標準(Bio-Rad,美國)、聚乙二醇1450(Polyethylene glycol 1450, PEG-1450)(Sigma,美國)、弗氏完全佐劑(Sigma,美國)、弗氏不完全佐劑(Sigma,美國)、硫氧還原蛋白(Thiooxygen-reducing protein, Trx)、組氨酸(Histidine, His)、牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin, BSA)(Sigma,美國)、杜爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified eagle′s medium, DMEM)(Gibco,美國)、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)(Gibco,美國)、胰酶(Gibco,美國)、低熔點瓊脂糖(UltraPure,上海)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-d-galactopyranoside, X-Gal)、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)、三羥甲基甲烷、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、曲拉通 X-100、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)均購自廈門泰京生物技術有限公司,其他試劑皆為國產分析純。

1.2 試驗設計與樣品采集

2017年3月,選健康、無病蟲害和籽粒飽滿的蓖麻種子種植于泉州師范學院試驗地,進行正常的土壤管理、水肥管理、整形修剪和病蟲害防治,7月采集蓖麻蓖麻生長根、一次分枝老葉、一次分枝新生葉、一次分枝雌花、一次分枝雄花、主莖、主莖果實和一次分枝果實,分別用液氮冷凍。

2017年3月,選試驗用花盆共40個,花盆規格為上口徑18 cm、下口徑15 cm、高18 cm,分別裝入土壤500 g、尿素0.125 g、磷銨0.100 g混勻,定量澆水至水不會溢出土壤表層。選健康、無病蟲害和籽粒飽滿的蓖麻種子共200顆,種植于花盆中,每盆種子數為5顆,置于日光溫室內進行常規養護管理。視盆土干濕狀況,定期定量澆水,以平衡蒸發量。出苗后,每盆定植1株。待盆中幼苗長到5～6片葉時,選取長勢基本一致的幼苗30盆,采用單因素隨機區組試驗設計,隨機分成6組,每組5盆,進行NaCl脅迫處理。NaCl濃度分別為0(CK),50,100,150,200,250 mmol/L。脅迫處理在17:00-19:00進行,每盆200 mL NaCl溶液分2次透灌,為避免蒸騰導致NaCl濃度的變化,用塑料將花盆口封好,以保持其濃度恒定。在處理第5天采集植株的根系,分別用液氮冷凍。

1.3 總RNA和總蛋白的提取

上述1.2中采集的蓖麻各組織用液氮分別研磨后,各組織的總蛋白質提取及其濃度測定、各組織的總RNA提取分別按試劑盒說明書進行,各組織的總RNA質量和濃度分別用2%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測。

1.4 mRNA的純化和cDNA的合成

從正常水肥管理蓖麻植株的生長根總RNA中純化mRNA,并以mRNA為模板合成cDNA第一鏈,分別按試劑盒說明書進行。分別從正常水肥管理和NaCl脅迫處理的蓖麻其他組織取1 μg總RNA,用試劑盒中提供的oligo-dT和隨機引物按試劑盒說明書分別合成cDNA,合成的cDNA用于后續qPCR試驗時按1∶5稀釋。

1.5 RcActin CDS的PCR擴增

根據GenBank中登錄的蓖麻RcActin(登錄號為XM_002522148.3)的全長序列設計1對特異性引物：5′引物：5′-CGGGATCC(BamH Ⅰ識別位點)ATGGCCGACGCCGAGG-3′,3′引物：5′-CCGCTCGAG(XhoⅠ識別位點)GTTGCACTTCCTGTGGAC-3′,以此進行PCR擴增得到RcActinCDS序列,PCR反應體系和反應條件分別見表1，2。

表1 PCR反應體系Tab.1 PCR amplification system

表2 PCR反應程序Tab.2 PCR amplification procedure

1.6 RcActin原核表達載體的構建

將PCR產物按試劑盒說明書純化。純化的PCR產物和pET32a(+)載體分別用BamH Ⅰ、XhoⅠ雙酶切后,進行瓊脂糖凝膠電泳,按試劑盒說明書分別回收酶切的PCR產物和pET32a(+)載體,再把二者用T4DNA連接酶連接。并把連接產物轉化到E.coli感受態細胞BL21,菌落在選擇培養基上培養后,挑選白色單克隆菌落分別培養,按試劑盒說明書提質粒,并通過BamH Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定篩選陽性重組質粒pET32a(+)-RcActin。經酶切鑒定的pET32a(+)-RcActin進行基因序列測定。

1.7 序列分析

用DNAMAN對RcActin的CDS序列、氨基酸編碼序列進行分析。

1.8 pET32a(+)-RcActin原核表達條件分析

將經測序鑒定的重組載體pET32a(+)-RcActin和空載體分別轉化E.coli感受態細胞BL21,分別挑選單菌落進行活化及誘導培養,用SDS-PAGE電泳檢測表達產物,方法按參考文獻[18]。

通過預試驗確定誘導pET32a(+)-RcActin表達量的基本條件為：誘導溫度28 ℃、誘導時間6 h、IPTG誘導濃度1.2 mmol/L。通過固定其他條件只改變其中一個條件來分析各單因素對pET32a(+)-RcActin表達量的影響。設置誘導溫度分別為4,16,28,37 ℃,誘導時間分別為0,1,2,3,4,5,6,7,8,9 h,IPTG誘導濃度分別為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mmol/L。

1.9 His-RcActin可溶性分析

按上述探索好的條件培養表達pET32a(+)-RcActin,收集誘導表達的菌體,用SDS-PAGE分析pET32a(+)-RcActin的表達形式,方法按參考文獻[19]。

1.10 融合蛋白His-RcActin純化及特異性分析

誘導表達pET32a(+)-RcActin,菌體沉淀用8 mol/L尿素變性增溶,融合蛋白His-RcActin用BeaverBeadsTM試劑盒純化。純化的融合蛋白His-RcActin按參考文獻[18]進行SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色檢測純化效果,采用Western Blot以稀釋的抗His標簽單克隆抗體檢測融合蛋白His-RcActin的反應原性和特異性。以純化的His-RcActin為抗原,鼠抗His單克隆抗體作為一抗(1∶10 000),HRP 標記的羊抗鼠 IgG 為二抗(1∶5 000),用 ECL 發光試劑盒曝光充分顯色,拍片保存。

1.11 Anti-RcActin McAb制備

選取3只6周齡的雌性BALB/c小鼠,取純化的His-RcActin與一定量的完全弗氏佐劑按1∶1的比例混合乳化后,在小鼠后腿肌肉注射進行免疫。2周后進行第2次免疫(不完全弗氏佐劑)。再2周后進行第3次加強免疫(不完全弗氏佐劑)。可在第3次免疫1周后從小鼠的尾靜脈采血,用間接ELISA法[18]測定小鼠血清中的抗體效價,選取效價高的小鼠進行增強免疫,于3 d后進行細胞融合。

將超強免疫小鼠的脾細胞和SP2/0細胞以1∶10的比例混合,用50% PEG為融合劑,將融合細胞加入96孔板中,置于37 ℃和5% CO2培養箱內,用HAT培養基篩選培養,培養8～14 d后,取細胞上清,用間接ELISA法進行檢測篩選陽性孔[18],陽性孔細胞用有限稀釋法克隆直至陽性單克隆率為100%。

將陽性雜交瘤細胞以2×105個細胞/mL的密度接種于25 cm2培養瓶培養。當細胞狀態最佳時,將細胞數量調至2×106個細胞/mL,然后將其接種到預先1周注射液體石蠟的BALB/c小鼠的腹腔。待小鼠腹部增大,觀察腹水的產生情況。1～2周后收集腹水,5 000 r/min離心5 min收集上清,用NAbTMProtein A/G Spin Kit,從新采集的腹水中純化出抗His-RcActin的McAb,具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.12 細胞上清、腹水和McAb效價測定

用間接ELISA法[18]進行測定。以純化的His-RcActin為抗原,以梯度稀釋的細胞上清、腹水和McAb為一抗,測定A450nm值。以分別與His-RcActin發生特異性反應的細胞上清、腹水和McAb的最大倍比稀釋度為各自效價。以抗原包被液作為空白對照,以正常小鼠血清作為陰性對照,標本孔的吸收值與陰性標本孔的吸收值的比值(P/N)>2.1時判斷為陽性。

1.13 Anti-RcActin McAb亞類鑒定

用SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒鑒定出上述抗anti-RcActin McAb的亞類,具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.14 Anti-RcActin McAb特異性鑒定

分別以1 g/mL載體Trx、Trx、His、BSA、純化的His-RcActin和蓖麻根總蛋白為抗原,以制備的anti-RcActin McAb的IgG為一抗,以HRP-羊抗鼠IgG為二抗,采用ELISA法檢測McAb的特異性。

在此基礎上,分別以純化的His-RcActin、蓖麻根總蛋白為抗原,用Western Blot驗證McAb的特異性。以純化的His-RcActin為抗原,純化的anti-RcActin McAb作為一抗(1∶10 000),HRP 標記的羊抗鼠 IgG 為二抗(1∶4 000)；以蓖麻根總蛋白為抗原,純化的anti-RcActin McAb作為一抗(1∶10 000),HRP 標記的羊抗鼠 IgG為二抗(1∶4 000),用WesternBrightTMECL Kit 曝光充分顯色,拍片保存。試驗中,以抗原包被液作為空白對照,以免疫前小鼠血清作為陰性對照。

1.15 Anti-RcActin McAb穩定性分析

對陽性細胞株分別進行體外傳19代和液氮凍存4個月后再復蘇處理,按步驟1.12的方法檢測培養上清中抗anti-RcActin McAb的效價。

1.16 RcActin在蓖麻各組織表達分析

分別提取1.2中采集的蓖麻各組織的總蛋白,蛋白質含量按試劑盒說明書進行。每個組織分別取1 mg蛋白質,用SDS-PAGE(12%分離膠)分析RcActin蛋白質的表達水平。RcActin蛋白質在蓖麻各組織中的表達情況用Western Blot檢測,一抗為anti-RcActin McAb(稀釋倍數為1∶10 000),二抗為HRP-羊抗鼠IgG(稀釋倍數為1∶4 000),用WesternBrightTMECL Kit 曝光,拍片保存。每次試驗設3次生物學重復,每個生物學重復至少進行3次技術重復[20]。以根的表達水平作對照。差異顯著性標準采用新復極差法(Duncan)。

分別提取1.2中采集的蓖麻各組織的總RNA并進行RT-qPCR。引物序列如下,qRcAc1：5′-GTCAGGTTATCACCATTGG-3′；qRcAc2：5′-TGTTACCATAAAGATCCTTC-3′。RT-qPCR反應體系(總體積10 μL)為： 0.2 μL 50×SYBR Green Solution,5 μL 2×Mix(dT),1 μL cDNA(相當于10 ng 總RNA),和每種引物分別為0.4 μL(200 nmol/L),RNase Free ddH2O補足至10 μL。擴增程序為：95 ℃,10 min；95 ℃,1 min,60 ℃,1 min,40個循環。用2-ΔΔCT法[21-22]計算RcActinmRNA相對表達水平,每個樣品重復3次,以根的表達水平作對照。

1.17 引物合成和DNA測序

由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 pET32a(+)-RcActin表達質粒構建及測序鑒定

A.RcActinCDS PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜：M1. DL2000 DNA分子量標準; 1.RcActinCDS產物。B. pET32a(+)酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜：M2. λ-Hind Ⅲ +φX174-HaeⅢ DNA分子量標準; 2. pET32a(+)經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切產物。C.RcActin基因片段酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜：M1. DL2000 DNA分子量標準; 3.RcActin基因片段經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切產物。D. pET32a(+)-RcActin酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜：M2. λ-Hind Ⅲ+φX174-HaeⅢ DNA分子量標準; 4. pET32a(+)-RcActin經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切產物。

A. Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product ofRcActinCDS： M1. DL2000 DNA molecular weight standard; 1. PCR product ofRcActinCDS. B. Agarose gel electrophoresis analysis of pET32a (+) vector by restriction digestion： M2. λ-HindⅢ +φX174-HaeⅢ DNA molecular weight standard; 2. pET32a(+) vector byBamH Ⅰ andXhoⅠ digestion. C. Agarose gel electrophoresis analysis of the target fragmentRcActinby restriction digestion： M1. DL2000 DNA molecular weight standard; 3. The target fragmentRcActinCDS byBamH Ⅰ andXhoⅠ digestion. D. Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant expression plasmid pET32a(+)-RcActinby restriction digestion：M2. λ-Hind Ⅲ +φX174-HaeⅢ DNA molecular weight standard; 4. The recombinant expression plasmid byBamH Ⅰ andXhoⅠ digestion.

圖1 重組表達載體pET32a(+)-RcActin構建的瓊脂糖電泳圖譜
Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of expression vector construction of pET32a(+)-RcActin

圖2 RcActin的cDNA序列和推斷的氨基酸序列Fig.2 The cDNA and deduced amino acid sequences of RcActin

以蓖麻根的cDNA為模板,用根據RcActin序列(GenBank登錄號為XM_002522148.1)設計的引物進行PCR擴增,獲得1 131 bp的CDS序列,與設計的片段長度相符(圖1-A)。把表達載體pET32a(+)和目的基因片段分別用BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切,酶切產物電泳(圖1-B、C)后分別進行回收,回收產物電泳估測濃度后,用T4DNA連接酶將二回收產物連接,連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α,挑取陽性單菌落培養,提質粒。質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切,可切出1 134 bp左右片段(圖1-D)。將經酶切驗證后的重組載體pET32a(+)-RcActin進行測序。測序結果表明(圖2),pET32a(+)-RcActin上的RcActin序列正確,未出現移碼,證明成功構建出pET32a(+)-RcActin重組表達載體。

2.2 重組載體pET32a-RcActin原核表達及可溶性分析

將表達載體pET32a(+)和重組載體pET32a(+)-RcActin分別轉化BL21(DE3),經菌落PCR檢測(圖3)后,隨機挑取陽性菌落誘導表達,由圖4可見,二者可分別誘導表達分子量為19.83,61.46 ku左右的特異蛋白(箭頭所指條帶)。所表達的蛋白質分子量與預期的分子量大小相一致。轉重組載體pET32a(+)-RcActin的BL21(DE3)在19.83 ku處未見表達蛋白帶,表明pET32a(+)-RcActin已成功地在大腸桿菌中表達,并形成了融合蛋白。

M. DL2000 DNA分子量標準; 1-5. 菌落PCR產物。M. DL2000 DNA molecular weight standard; 1-5. Product of colony PCR.

pET32a(+)-RcActin原核表達條件的優化見圖4。結果表明,表達條件的誘導溫度為28 ℃(圖4-A),誘導時間為5 h(圖4-B),IPTG誘導濃度為0.4 mmol/L(圖4-C)。此條件下誘導表達的BL21重組菌經離心收集菌體,菌體經超聲波裂解,用SDS-PAGE分析裂解后的上清和沉淀,pET32a(+)-RcActin表達蛋白存在菌體裂解液沉淀中,即以包涵體形式表達,結果見圖4-D。

A.誘導溫度對His-RcActin表達量影響的SDS-PAGE圖譜：M. 蛋白分子量標準; 1. pET32a(+)未誘導; 2. pET32a(+)誘導; 3. pET32a(+)-RcActin未誘導; 4-7. pET32a(+)-RcActin分別在4, 18, 28, 37 ℃誘導時表達產物；白色箭頭所示為目的蛋白條帶(下同)。B. 誘導時間對His-RcActin表達量影響的SDS-PAGE圖譜：M、1-3. 同A; 4-12. pET32a(+)-RcActin分別在1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 h誘導時表達產物。C. IPTG誘導濃度對His-RcActin表達量影響的SDS-PAGE圖譜：M、1-3. 同A; 4-9. pET32a(+)-RcActin分別在0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 mmol/L誘導時表達產物。D. His-RcActin可溶性分析SDS-PAGE圖譜：M、1-3. 同A; 4. pET32a(+)-RcActin誘導菌體的裂解液; 5. pET32a(+)-RcActin誘導菌體的裂解沉淀液; 6. pET32a(+)-RcActin誘導菌體的裂解上清液。

A. SDS-PAGE analysis of the influence of different induction temperature on the expression of His-RcActin inE.coli： M. Protein molecular weight standard; 1. pET32a(+) transformed bacterial cells before IPTG induction; 2. pET32a(+) transformed bacterial cells induced for 6 h by 1.2 mmol/L IPTG; 3. The recombinant plasmid pET32a(+)-RcActin transformed bacterial cells before IPTG induction; 4-7. The recombinant plasmid pET32a(+)-RcActintransformed bacterial cells induced by 1.2 mmol/L IPTG for 6 h at 4, 18, 28, 37 ℃ respectively; White arrow shows the recombinant His-RcActin (the same as following). B. SDS-PAGE analysis of the influence of different induction time on the expression amount of His-RcActin inE.coli:M, 1-3. The same as A; 4-12. The recombinant plasmid pET32a(+)-RcActintransformed bacterial cells induced by 1.2 mmol/L IPTG for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 h, respectively. C. SDS-PAGE analysis of the influence of different IPTG concentration on the expression amount of His-RcActin inE.coli：M, 1-3. The same as A; 4-9. The recombinant plasmid pET32a(+)-RcActintransformed bacterial cells induced by 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 mmol/L IPTG, respectively. D. SDS-PAGE analysis of the His-RcActinprotein solubility:M, 1-3. The same as A; 4. Lysate liquid of the recombinant plasmid pET32a(+)-RcActintransformed bacterial cells induced; 5. The precipitation of the recombinant plasmid pET32a(+)-RcActin transformed bacterial cells induced; 6. The supernatant of the recombinant plasmid pET32a(+)-RcActintransformed bacterial cells induced.

圖4 pET32a(+)-RcActin原核表達條件優化的SDS-PAGE圖譜
Fig.4 SDS-PAGE analysis of optimize expression condition of pET32a(+)-RcActininE.coli

2.3 His-RcActin融合蛋白純化

pET32a(+)-RcActin經誘導表達增溶后,用BeaverBeadsTM試劑盒純化,純化產物His-RcActin經SDS-PAGE驗證,在凝膠泳道上只顯示與目的蛋白大小相符的單一條帶(圖4-D)。以抗6X His標簽抗體為一抗,經Western Blot驗證,結果顯示在純化蛋白的泳道上只出現一條接近61.46 ku的條帶(圖5),可見His-RcActin能與抗His標簽抗體發生特異性結合,說明His-RcActin表達成功,具有較好的免疫反應性和抗原性。

M. 蛋白分子量標準; 1. SDS-PAGE圖譜中His-RcActin純化產物的條帶; 2. Western Blot中His-RcActin的純化產物與抗6個組氨酸標簽抗體特異性結合復合物的條帶。

M. Protein molecular weight standard; 1. Bands of purified His-RcActin in SDS-PAGE; 2. Bands of the complex produced by the purified His-RcActin products specifically bound to anti-6X histidine tag antibodies in Western Blot.

圖5 純化His-RcActin的SDS-PAGE圖譜和Western Blot 驗證
Fig.5 SDS-PAGE and Western Blot analysis of purified His-RcActin

2.4 Anti-RcActin McAb制備及其性質分析

2.4.1 Anti-RcActin McAb的制備及腹水效價分析 His-RcActin免疫后的小鼠脾細胞與雜交瘤細胞進行成功融合后,經過3次的有限稀釋克隆,獲得9株分泌anti-His-RcActin McAb的細胞株(1B3E4、1B3G4、1F1F9、2A3B2、2A3B3、2F4G4、2G10D5、3B5F7、3C8E4), 其中,5株陽性單克隆細胞株體外誘導法制備的腹水效價達到1 000 000及以上(表3)。

表3 腹水效價的間接ELISA測定Tab.3 Indirect ELISA assay of the titers of ascitics

2.4.2 Anti-RcActin McAb純化 分別新鮮采集利用5株高效價陽性單克隆細胞株制備的腹水,用NAbTMProtein A/G Spin Kit分別從腹水中純化anti-His-RcActin的McAbs,McAb配制成終濃度1 mg/L。

2.4.3 Anti-RcActin McAb特異性鑒定 純化所得的5株McAbs均與His、BSA無交叉反應,1F1F9株和3B5F7株與載體Trx有交叉反應,說明這2株細胞產生的抗體為標簽蛋白特異性抗體,其余3株為anti-RcActin的特異性McAbs。

2.4.4 Anti-RcActin McAb亞型鑒定 3株anti-RcActin McAb亞型均為IgG1類免疫球蛋白,見圖6。

圖6 Anti-RcActin McAb亞型鑒定Fig.6 Identification of the anti-RcActin McAb subtype

2.4.5 Anti-RcActin McAb穩定性和效價分析 選獲得的1B3E4、2G10D5和3C8E4細胞株體外傳19代后,采用檢測細胞上清中McAb的效價,從表4可知,其中1B3E4和3C8E4細胞上清中McAb的效價隨傳代數增加而急劇下降,2G10D5細胞上清中McAb的效價則相對穩定,傳至第19代效價基本保持不變,仍然可以達到1∶128 000。將凍存于液氮中的1B3E4、2G10D5和3C8E4細胞分別復蘇培養來生產McAb,結果表明,凍存4個月后2G10D5細胞株McAb的效價也基本未變,可以達到1∶128 000,說明2G10D5細胞株的穩定性好。

表4 傳代細胞上清中anti-RcActin McAb的效價Tab.4 Titer of anti-RcActin McAb in supernatant of cell passage

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) ；同一行數據中字母相同表示無顯著性差異；-.未測定。

Note：Different small letters indicate significant difference (P<0.05); The same letters in the same line indicate no significant difference;-.No measurement data.

以純化的His-RcActin為抗原,以小鼠免疫前血清作為陰性對照,將從2G10D5細胞株制備的腹水中純化的anti-RcActin McAb進行等倍稀釋,采用間接ELISA法檢測。結果表明,anti-RcActin McAb效價達到1∶512 000(圖7)。

a.表示不同稀釋倍數對應樣品孔的吸光度值/陰性對照孔的吸光度值>2.1。a.The multiples of the absorbances of the sample wells corresponding to different dilution multiples to the absorbance value of the negative control wells is greater than 2.1.

2.4.6 Anti-RcActin McAb特異性的Western Blot驗證 當以純化的anti-RcActin McAb作為一抗,HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,抗原分別為原核表達純化產物His-RcActin和蓖麻根總蛋白時,經Western Blot分析(圖8)表明,anti-RcActin McAb不僅可與在大腸桿菌中表達并純化的anti-His-RcActin McAb進行特異性反應,還可與蓖麻根總蛋白進行特異性反應。

M. 蛋白分子量標準; 1. 抗原為His-RcActin原核表達純化產物, 一抗為純化的anti-RcActin McAb; 2. 抗原為His-RcActin原核表達未純化產物, 一抗為純化的anti-RcActin McAb; 3. 抗原為蓖麻根總蛋白, 一抗為純化的anti-RcActin McAb; 4. 抗原為蓖麻根總蛋白, 一抗為正常小鼠的血清。

M. Protein molecular weight standard; 1. Purified product of His-RcActin prokaryotic expression as antigen, purified anti-RcActin McAb as primary antibody; 2. No-purified product of His-RcActin prokaryotic expression as antigen, purified anti-RcActin McAb as primary antibody; 3. The total protein in roots fromR.communisas antigen, immune serum as primary antibody, purified anti-RcActin McAb as primary antibody; 4. The total protein in roots fromR.communisas antigen, serum from normal mice as primary antibody.

圖8 Anti-RcActin McAb特異性的Western Blot分析
Fig.8 Western Blot analysis of anti-RcActin McAb

2.5 RcActin基因在蓖麻各組織表達

利用Western Blot方法檢測蓖麻生長根、一次分枝老葉、一次分枝新生葉、一次分枝雌花、一次分枝雄花、主莖、主莖果實和一次分枝果實在正常水肥管理且時空一致條件下RcActin的表達量,并進行分析,結果如圖9所示。RcActin在這些組織中均有表達,并且在各組織的含量存在顯著性差異(P<0.05)。利用qRT-PCR方法分析RcActinmRNA在上述組織中的表達量,結果如圖10所示。RcActinmRNA在各組織的表達量存在顯著性差異(P<0.05)(圖10),在生長根、一次分枝新生葉、主莖果實和一次分枝果實等幼嫩和迅速生長的組織中RcActinmRNA的表達量較高,顯著高于在一次分枝雌花、一次分枝雄花和主莖中的表達量,并且生長根和一次分枝新生葉的表達量顯著高于主莖果實和一次分枝果實。

1.生長根;2.一次分枝老葉;3.一次分枝新生葉;4.一次分枝雌花;5.一次分枝雄花;6.主莖;7.主莖果實;8.一次分枝果實。圖中小寫字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。圖10-12同。

1.Growing roots; 2.Old leaves of primary branches; 3.Young leaves of primary branches; 4.Female flowers of primary branches; 5.Male flowers of primary branches; 6.Main stems; 7.Fruits of main stems; 8.Fruits of primary branches.The same letters in the figure mean no significant difference, while different letters mean significant difference(P<0.05). The same as Fig.10-12.

圖9 RcActin在正常水肥管理且時空一致條件下蓖麻不同組織中的表達量
Fig.9 Protein expression of RcActin in different tissues fromR.communisplants growing normally under normal water and nitrogen management

圖10 RcActin mRNA在正常水肥管理且時空條件一致條件下的蓖麻不同組織中的表達量Fig.10 mRNA expression of RcActin in different tissues from R.communis plants growing normally under normal water and nitrogen management

通過Western Blot方法分析RcActin蛋白質在不同濃度NaCl脅迫下盆栽蓖麻根系中的表達量,結果如圖11所示。與對照相比,RcActin蛋白質的表達量隨脅迫濃度的增強呈先上升后下降的趨勢。50～100 mmol/L NaCl脅迫下,RcActin蛋白質表達量無顯著性變化(P>0.05)；100～200 mmol/L NaCl脅迫下,其表達量顯著上升(P<0.05)；而200～250 mmol/L NaCl脅迫下,其表達量顯著下降(P<0.05)。利用qRT-PCR方法分析RcActinmRNA在上述組織中的表達量,結果如圖12所示。RcActinmRNA與其蛋白質的變化模式不同。50～100 mmol/L NaCl脅迫下,RcActinmRNA的表達量無顯著變化；但100～250 mmol/L NaCl脅迫下,其表達量均顯著上升(P<0.05)。

圖11 RcActin在不同濃度NaCl脅迫下盆栽蓖麻根系中的表達量Fig.11 Protein expression of RcActin in the roots from R.communis plants potting under NaCl stress at different concentrations

圖12 RcActin mRNA在不同濃度NaCl脅迫下盆栽蓖麻根系中的表達量Fig.12 mRNA expression of RcActin in the roots from R.communis plants potting under NaCl stress at different concentrations

3 討論與結論

在利用RT-qPCR和Western Blot進行目的基因表達的研究時,選擇一個穩定表達的基因作為參考基因至關重要[23]。目前已有關于植物不同組織和非生物脅迫下內參基因篩選的研究報道。Actin基因具有高度的保守性和表達穩定性,常用作植物基因表達分析中的內參之一[24]。高等植物Actin基因同動物Actin基因一樣,屬于多基因家族,其基因是多拷貝的[25],Actin基因存在異構體,Actin基因的異構體在一級結構上的同源性很高,但時空表達調控方式不同,表達具有組織特異性[26-27],并非所有的植物Actin基因均穩定表達。Czechowski等[12]研究表明,擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)的Actin2(AT3G18780)和Actin7(At5g09810)的表達在不同的發育階段不穩定,并且Actin2的表達在NaCl脅迫處理下穩定性差；Vashisth等[28]篩選高叢藍莓(VacciniumcorymbosumL.)中穩定的內參基因時發現,Actin7(CF811156)的表達在不同組織中不穩定；割手密(SaccharumspontaneumL.)β-Actin(CA148161)的表達在NaCl脅迫處理下不穩定[29]。本研究結果表明,蓖麻RcActinmRNA在不同的組織中和NaCl脅迫處理下均不穩定,這與前人研究結果一致。

目前，內參基因的篩選主要是利用RT-qPCR技術從mRNA水平進行研究[1-13, 28-29]。某基因即便于一定的生理條件下在轉錄水平上穩定表達,但由于基因表達的復雜網絡調控系統的變化,也可能導致其在翻譯過程中存在顯著差異。因此,基因表達分析時所用的參考基因應該是特定物種在特定處理中mRNA水平和/或翻譯水平都相對穩定表達的基因[30]。本研究不僅從mRNA水平,也從蛋白質水平對蓖麻RcActin在不同組織中和NaCl脅迫處理下的表達進行了分析。大量研究表明,不同試驗條件下最適候選內參基因存在差異[31],因此,蓖麻RcActin能否作為或在什么樣的試驗條件下可作為參考基因,還需通過分析不同時空條件下和不同試驗條件下該基因詳細的 mRNA和蛋白質表達模式來進行綜合評價。

本研究采用 RT-PCR 技術克隆蓖麻的RcActin的CDS,構建原核表達載體 pET32a(+)-RcActin,表達并純化獲得61.46 ku的融合蛋白His-RcActin,并以此作為抗原制備抗蓖麻RcActin蛋白質McAb。以制備的McAb為一抗,利用Western Blot方法分析RcActin蛋白質在正常水肥管理且時空一致條件下的蓖麻不同組織中和在NaCl脅迫條件下在根中的表達水平；RT-qPCR分析蓖麻RcActinmRNA在上述各組織中的表達水平,結果表明,蓖麻各組織中RcActin蛋白質和RcActinmRNA的表達量均有顯著差異；蓖麻根中RcActin蛋白質和RcActinmRNA的表達量在NaCl脅迫條件下不穩定。RcActin表達研究為蓖麻基因表達分析中內參基因的篩選提供了一定的理論依據。