結縷草Zjlea3基因逆境響應模式及抗逆功能鑒定

閆逢英,農鈞繡,鎖忠花,韋善君

(中央民族大學 生命與環境科學學院,北京 100081)

植物不能主動避害,而自然環境是多變的。為了能夠在一定的環境中存活下來,植物在長期的生物進化過程中建立了一定的機制來抵御不良環境,這種機制與脅迫誘導的一系列基因表達改變所引起的生理效應密切相關[1]。首先,非生物脅迫能夠引起新蛋白在植物營養組織中積累,該類蛋白被稱為逆境脅迫誘導蛋白[2]；其次,甘氨酸甜菜堿、脯氨酸、糖醇等低分子量的滲透調節物在脅迫條件下積累,這些改變能夠顯著提高植物對干旱、高鹽和滲透脅迫的適應和耐受能力[3-4]。

晚期胚胎富集蛋白(Late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白)被認為是一類與植物抵御非生物脅迫密切相關的蛋白。在胚胎發育晚期的棉花子葉中,Dure等[5]首次分離得到一組mRNA,并且將其命名為lea mRNA,同時還分離得到其翻譯產物,即LEA蛋白。隨后的研究結果表明該類蛋白在生物體內廣泛存在,包括高等植物(大麥、玉米、大豆、水稻等)[6]、苔蘚[7]、藻類[8]、蕨類植物、細菌和無脊椎動物[9]。有大量的試驗研究結果證實,能夠被低溫、干旱等非生物脅迫誘導表達的LEA蛋白可以通過結合金屬離子、清除活性氧自由基以及保護酶活性和膜系統等方式保護植物的新陳代謝[10],從而增強植物的抗逆性。Battaglia等[11]根據蛋白的親水性系數和保守結構域等,將LEA蛋白分為7組。然而,隨著更多的LEA蛋白被發現,其分類也愈發復雜?；贒ure′s group分類標準,根據LEA基因推導出的氨基酸的相似性至少可以將其分為6組。其中,第3組LEA蛋白具有特征性的11氨基酸基序(FF[E/Q]XFK[E/Q]KFX[E/D/Q]),其第1，2，5和9位為疏水性殘基(F),第3，7和11位為帶負電荷或氨基的殘基(E、D、Q),第6和8位為正電荷殘基(K),第4和10位為任何殘基(X)。基序拷貝數量和其中殘基的多樣性決定了第3組蛋白的分子量和序列是多樣的。

日本結縷草(Zoysiajaponica)是禾本科畫眉亞科多年生的暖季型C4草本植物,具有對高溫、干旱等多種非生物脅迫耐受能力強的特征,極耐踐踏,被廣泛建植于運動場、園林、高爾夫球場、庭院和機場中,是較好的固土護坡植物和較為理想的運動場草坪草。揭示結縷草抵御非生物脅迫的分子機制不僅可以指導結縷草的育種工作,而且對其他植物的育種工作也有參考價值。本研究報道結縷草LEA蛋白家族中的一個基因Zjlea3,分析其生物信息學,檢測了其在不同逆境脅迫下的表達模式,并且在酵母細胞中對其抗逆功能進行了初步評價,為抗逆研究提供了新的候選基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為日本結縷草Meyer。植物總RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA快速回收試劑盒和T-載體(pUM-T)均購自北京百泰克有限公司。T4DNA連接酶和M-MLV逆轉錄酶均購自Promega公司。質粒載體pDEST32、酵母AH109菌株和大腸桿菌感受態細胞DH5α由中央民族大學植物分子生物學實驗室提供。試驗所用引物由上海生工合成及測序,引物序列及用途見表1所示。

表1 引物序列及用途Tab.1 Sequence and usage of primers

1.2 材料培養及試驗處理

在植物培養室內培養試驗材料,基質為蛭石∶珍珠巖∶營養土=1∶1∶2的混合物,室內溫度為25 ℃/20 ℃(L/D),光強為200 μmol/(m2·s),光周期14 h。對植物材料分別進行低溫、干旱和高鹽脅迫處理,處理方法參見馮婉倩等[12]的方案。在逆境處理時間分別為2,12,24,72 h時取各處理植株頂端的第1～2片展開葉,于液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 總RNA提取、cDNA合成及Zjlea3基因的克隆

在液氮中將凍存的葉片研磨成粉末狀,利用試劑盒提取總RNA。提取的RNA產物分別用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)檢測其濃度。用M-MLV逆轉錄酶將mRNA反轉錄為cDNA。試驗的具體操作按照試劑盒提供的說明書進行。

以4 ℃處理72 h的cDNA為模板,使用引物對P1來擴增目的基因的編碼區序列,擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。Zjlea3基因的克隆方法參見李京等[13]的方案。

1.4 Zjlea3基因生物信息學分析

采用表2中的生物信息學相關軟件推測Zjlea3基因編碼的氨基酸序列及其理化性質,預測蛋白質的二級結構,進行跨膜區分析和構建系統發育樹。

表2 生物信息學分析使用的相關軟件及網址Tab.2 The bioinformatics analysis softwares and website

1.5 逆境脅迫下Zjlea3基因的表達模式

以不同脅迫處理的cDNA為模板,以actin1(NCBI accession No.:GU290545)為內參基因,使用特異性引物對P2、actin1進行熒光定量PCR,檢測不同逆境脅迫處理下葉組織Zjlea3基因的相對表達量。反應體系和程序參見Feng等[14]的方案。設定對照組的基因表達量為1,用2-ΔΔCt來表示不同脅迫處理組中目的基因的相對表達量。

1.6 Zjlea3基因轉化酵母細胞

改造酵母表達載體pDEST32(圖1-A),保留其BD結構域,得到pyeast質粒載體(圖1-B),將Zjlea3取代pyeast載體中的BD結構域,得到Zjlea3表達載體pyeastZjlea3(圖1-C)。將pyeast(陰性對照)和pyeastZjlea3重組質粒分別轉入酵母AH109菌株感受態細胞中,在30 ℃ SD/Leu-(亮氨酸缺陷型培養基)培養基上培養以篩選轉化子。

A. 酵母表達載體pDEST32；B. 陰性對照載體pyeast；C. Zjlea3表達載體。PADH1和TADH1分別為酵母乙醇脫氫酶1啟動子和終止子,GAL4 BD為酵母GAL4轉錄因子的DNA結合結構域。A. Yeast expression vector pDEST32; B. Negative control vector pyeast; C. Zjlea3 expression vector.PADH1 and TADH1 are promoters and terminators of yeast alcohol dehydrogenase 1, respectively，GAL4 BD is the DNA binding domain of yeast GAL4 transcription factor.

1.7 酵母細胞抗逆能力評價

抗凍能力評價是用無菌水制備酵母細胞懸濁液并稀釋到合適的濃度,于-20 ℃的低溫中分別冷凍處理0(對照),24,48,72 h后,取100 μL涂布在Leu-的固體培養基上,于30 ℃培養,2 d后計菌落數。以未經低溫處理(0 h)組的存活率(100%)為參照,計算存活率[1]?？垢啕}能力評價是在NaCl濃度分別為0,0.4,0.8,1.2 mol/L的SD/Leu-液體培養基(3 mL)中加入OD600為0.2的酵母菌懸液40 μL,培養24 h后測定OD600的值,根據渾濁度差異評價酵母細胞的耐鹽能力。耐高滲能力評價是在培養基中添加濃度分別為0,0.4,0.8,1.2,1.6 mol/L的山梨醇,其他與耐鹽評價方法相同。以上試驗中的每個處理均設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 Zjlea3基因的序列特征

根據前期的轉錄組數據設計引物對P1,對4 ℃處理72 h的cDNA進行PCR擴增,獲得了一條約500 bp的高亮度特異帶。經克隆、測序后獲得其核酸序列,在NCBI上進行BlastX分析結果顯示,該序列與多種植物LEA蛋白家族中的第3組基因高度相似,因而命名為Zjlea3。

Zjlea3基因能夠編碼177個氨基酸,且其中含有9個拷貝的由11氨基酸組成的基元序列(圖2)。Zjlea3蛋白的預測分子質量為18.3 ku,理論等電點(pI)為5.63,且其主要氨基酸組成為丙氨酸(Ala)18.1%、蘇氨酸(Thr)13.6%、賴氨酸(Lys)12.4%、谷氨酰胺(Gln)9.0%、甘氨酸(Gly)9.0%、谷氨酸(Glu)8.5%、絲氨酸(Ser)7.3%、天冬氨酸(Asp)7.3%,無半胱氨酸和色氨酸,氨基酸平均親水性指數(GRAVY)為-1.134,這些結果表明，Zjlea3基因能夠編碼一個親水性強的小分子蛋白質。蛋白二級結構預測結果顯示,該蛋白的二級結構主要是α-螺旋(Hh)、無規則卷曲(Cc),所占比例分別為78.53%,16.38%,另外2種結構為延伸鏈(Ee)2.82%、β-折疊(Tt)2.26%(圖3)。蛋白跨膜區分析結果表明,Zjlea3蛋白的第1-177位氨基酸均位于細胞膜表面,暗示該蛋白不含有跨膜區,屬于非跨膜蛋白(圖4)。

陰影部分為Zjlea3基因編碼氨基酸序列中的11氨基酸基元序列。The shaded part is the 11 amino acid motif sequence in the amino acid sequence encoded by Zjlea3 gene.

Hh. α-螺旋；Ee. 延伸鏈；Tt. β-折疊；Cc. 無規則卷曲；數值代表氨基酸位點。Hh.α-helix; Ee.Extended strand; Tt.β-turn; Cc.Random coil; The number represents the amino acid position.

圖4 Zjlea3蛋白氨基酸序列跨膜分析Fig.4 Transmembrane analysis of Zjlea3 protein

2.2 Zjlea3蛋白的系統發育樹

在NCBI網站上對Zjlea3基因編碼的氨基酸序列進行在線Blast分析,結果顯示,與Zjlea3蛋白氨基酸序列相似度最高的前40個蛋白序列來自22個物種,其中數量最多的前2個物種同屬于高粱族,為金發草(Pogonatherumpaniceum)和高粱(Sorghumbicolor),分別有6,5個同源蛋白。使用Mega 7.0軟件對Zjlea3和這40個蛋白質氨基酸序列進行聚類分析,結果表明，Zjlea3蛋白主要與高粱族和小麥族植物聚在一起形成一個分支,在這個分支中還包含能夠在凍土中生長的南極發草(Deschampsiaantarctica)和能夠在干燥環境中生長的冰草(Agropyroncristatum)。Zjlea3蛋白與高粱屬(S.Moench)中的3個物種高粱(S.bicolor)、蘆葦狀高粱(S.arundinaceum)、石茅(S.halepense)的同源蛋白親緣關系最近,4個蛋白形成一個小分支(圖5)。

2.3 Zjlea3基因表達的逆境響應模式

如圖6所示,在正常生長條件下,Zjlea3基因僅有少量表達。經4 ℃低溫處理2 h后,其表達量呈現上調趨勢,在12 h時其表達量進一步積累,隨后出現下降,而在72 h時表達量達最大值。在PEG-6000模擬的干旱脅迫處理下,Zjlea3基因的相對表達量出現下降后上調又下降的趨勢,且在脅迫處理24 h時表現出顯著的上調。在高鹽脅迫下,Zjlea3基因的相對表達量則呈現出先降低后上調的趨勢,且在處理72 h時達到最高水平。以上結果顯示,低溫、干旱以及高鹽3種非生物脅迫對Zjlea3基因的表達均有不同程度的誘導效應,暗示結縷草Zjlea3基因參與多種逆境脅迫應答,但是對不同逆境脅迫的敏感性有差異。

圖5 Zjlea3蛋白的系統進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of Zjlea3 protein

2.4 Zjlea3基因的抗逆功能

為了解Zjlea3基因在抵御非生物脅迫中的作用,構建了Zjlea3的酵母表達載體pyeastZjlea3并轉化到酵母AH109菌株感受態細胞中,在酵母細胞中評價其抗凍、抗高鹽以及抗高滲透功能。

對轉化了pyeastZjlea3和pyeast(陰性對照)的酵母細胞進行-20 ℃低溫處理24,48,72 h后,涂板,統計菌落數,細胞存活情況如圖7所示。在低溫處理24 h時,含pyeastZjlea3和pyeast的酵母細胞存活率分別為42.25%,17.29%,在低溫處理48 h時的存活率分別為25.31%,6.46%。說明2種酵母細胞的存活率隨著低溫處理時間的延長而逐漸降低,但是在相同處理時間內,轉pyeastZjlea3的酵母細胞的存活率均高于轉pyeast的酵母細胞,Zjlea3基因具有增強細胞耐受冷凍低溫的能力。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著(P<0.05)。Different small letters mean significant difference (P<0.05).

不同小寫字母表示pyeast和pyeastZjlea3差異顯著(P<0.05)。圖8同。Different small letters indicate significant difference between pyeast and pyeastZjlea3 (P<0.05). The same as Fig.8.

在含有不同鹽濃度的培養基中接種同量的種子菌,培養24 h后測定菌懸液的OD600,結果如圖8所示。在鹽濃度不超過0.4 mol/L時,2種細胞懸濁液的濁度與對照組差異不顯著,說明該條件下酵母細胞均未受到顯著脅迫。當NaCl濃度為0.8～1.2 mol/L時,2種細胞懸濁液的濁度均下降,但是相同脅迫條件下含pyeastZjlea3重組質粒的酵母細胞OD600值顯著高于載有pyeast質粒細胞的OD600值。說明該條件下2種細胞均受到的脅迫,生長量下降,但是轉化Zjlea3基因后增強了對高鹽的耐受性,細胞受到的影響小。

在含有不同濃度山梨醇的培養基中振蕩培養分別轉化了pyeast和pyeastZjlea3的酵母細胞,24 h后測定OD600,結果如圖8所示。在不同山梨醇濃度的處理條件下,轉化pyeastZjlea3重組質粒的酵母細胞OD600值顯著高于轉化pyeast的酵母細胞OD600值,且隨著山梨醇濃度的增加,2種酵母細胞的OD600值均呈現先上升后降低的趨勢。該試驗結果表明,Zjlea3基因在抗高滲脅迫過程中也起一定的作用。

圖8 鹽、高滲脅迫下酵母細胞的生長量Fig.8 The growth of yeast cells under salt stress and hypertonic stress

3 結論與討論

LEA蛋白在抵御干旱、高鹽、高滲、冷凍等非生物脅迫中起著關鍵的作用。結縷草具有較強的逆境耐受性特征,其lea基因的抗逆功能值得研究。本研究報道了結縷草LEA蛋白第3組中的一個基因,命名為Zjlea3。

多數LEA蛋白的相對分子質量較小,為10～30 ku[15],在結構體系上有一定的共性,Cys和Trp殘基比率低,而Arg、Lys、Gly、Ala、Thr和Gly比率高,親水指數大于1,Gly比率大于6%[11]。結縷草Zjlea3基因編碼177個氨基酸,Ala、Thr和Lys的含量均大于10%,Gly含量為9.0%,不含Cys和Trp,平均親水性指數為-1.134,預測分子質量為18.3 ku,屬于親水性強的小分子蛋白質,符合lea3蛋白的特征。

LEA蛋白第3組成員的共同特征是含有多拷貝的11氨基酸基元序列,少則5個,多則可達幾十個[16]。本研究報道的Zjlea3蛋白含有9個拷貝的11氨基酸基元序列,這種串聯基元序列的重復次數與植物抗逆性的關系尚不清楚。蛋白的二級結構分析顯示Zjlea3蛋白的組成結構大部分為α-螺旋(Hh)和無規則卷曲(Cc),該結構特征可能與其抗逆功能相關。高比例的α-螺旋(Hh)結構使蛋白具有一定的流動性和柔性,從而在分子內形成氫鍵,使蛋白質分子具有無規則卷曲結構,能夠在各個方向伸展、拉長和彎曲[6],同時無規則卷曲(Cc)結構有助于與水分子結合,可以作為水分結合蛋白防止細胞內水分的喪失和高濃度的Na+和Cl-對細胞的毒害[17-18],從而能夠在細胞受到非生物脅迫時起到保護功能,提高植物的抗逆能力。在Zjlea3蛋白的系統進化樹中,Zjlea3蛋白與具有耐高溫、抗旱、耐鹽堿的高粱、石茅的同源蛋白的親緣關系最近。結縷草耐高溫、干旱和貧瘠,石茅生命力強,生長在山谷、河邊或荒野中,高粱具有耐高溫、抗旱、抗澇、耐鹽堿、耐貧瘠的特點,三者的抗逆特征相似,LEA蛋白基因相似度也最高,推測其同源LEA蛋白與抗逆境脅迫密切相關。

LEA蛋白在非生物脅迫條件下具有保護膜系統、結合金屬離子、清除活性氧自由基和保護酶活性的功能[19]。有研究表明,當細胞中水分缺失時,LEA蛋白能夠捕捉足夠的水分到細胞內,保護細胞免受水分脅迫的傷害,從而降低細胞死亡率[20]。大量的試驗結果表明,在逆境脅迫下lea基因轉錄的mRNA和翻譯產生的蛋白可以被大量誘導。例如Liu等[21]發現水分脅迫可誘導玉米中Zmlea3基因表達量上調。轉基因研究結果表明,lea3基因表達后可顯著增強植株的抗逆能力。Xu等[22]將大麥lea基因HVA1轉入水稻后得到轉基因水稻植株,該植株的抗旱和抗高鹽能力大大提高,轉入該基因的轉基因煙草和桑樹的抗旱和抗鹽能力也得到顯著增強[23-24]。張妍等[25]研究發現導入大麥lea3基因后獲得的轉基因水稻植株具有較強的抗旱以及耐鹽能力。王瑛等[26]利用基因槍法將大麥的lea3基因導入苜蓿愈傷組織中,獲得的轉基因植株的耐鹽能力得到顯著提高。本研究結果顯示,結縷草Zjlea3基因表達受低溫、高鹽和高滲脅迫誘導,這與前人的研究結果一致。與干旱(PEG-6000)和高鹽(NaCl)脅迫相比,低溫脅迫對Zjlea3基因表達的誘導強度最大,這可能與結縷草對低溫敏感相關。在低溫脅迫試驗中觀察到結縷草葉片內卷明顯,說明此條件下葉片缺水嚴重。酵母細胞抗逆試驗的研究結果顯示,Zjlea3可以增強細胞在冷凍低溫條件下的存活率,增強細胞在高滲和高鹽(NaCl濃度≥0.8 mol/L)脅迫下的活性,說明該基因具有抗逆功能,可能在結縷草抗逆過程中發揮重要作用。

綜上所述,結縷草Zjlea3基因是LEA蛋白家族第3組成員之一,具有抗逆功能。在低溫、高鹽和干旱逆境脅迫下,結縷草葉組織中Zjlea3基因表達量顯著上調,推測該基因與抗逆活動相關。本研究為進一步研究結縷草LEA蛋白與抗逆境脅迫的關系奠定了基礎。