甘藍原生質體制備體系優化及瞬時轉化體系的建立

王 飛,鐘雄輝,陳登輝,李海龍,康俊根,頡建明

(1.甘肅農業大學 園藝學院,甘肅 蘭州 730070；2.北京市農林科學院 蔬菜研究中心,農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,北京 100097)

植物原生質體是指植物細胞通過酶解法、機械法等手段去除細胞壁,形成由單層細胞膜包裹的細胞質[1]。去除了細胞壁的植物原生質體,不僅保持著細胞全能性,而且容易接受外源遺傳物質,使外源DNA在原生質體中快速表達[2]。因此,原生質體被廣泛用于遺傳轉化、細胞融合及細胞無性系和突變體的選育[3]。

植物原生質體瞬時表達系統是一種快速、高通量、轉化簡單的分析系統,被廣泛應用于基因瞬時表達、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質互作和蛋白質活性等研究[4],目前已有多種轉化方法,如PEG介導的原生質體轉化,基因槍轟擊法和農桿菌介導法[5]。但是,目前原生質體的遺傳轉化主要集中在擬南芥、水稻和煙草等模式植物[6]。原生質體的分離和純化不僅對植物瞬時表達體系的建立起著決定性的作用,同時也是原生質體融合以及植物體再生研究的基礎,原生質體的分離方法主要有機械法、化學法和酶解法等。其中,酶解法是應用最廣泛、最快速且高效的原生質體分離方法[7]。分離和純化大量有活力的植物原生質體易受到多種因素的影響,如酶種類及濃度、酶解時間、滲透壓濃度以及外植體類型等[8]。近年來,關于植物原生質體分離與轉化的研究越來越多,其中煙草、擬南芥、水稻的原生質體分離純化體系已相對成熟。劉敏等[9]研究了煙草葉片原生質體制備及其在蛋白互作中的應用；梁蕓等[10]分離純化出大量優質擬南芥原生質體并將CPK10雙元TAP載體在擬南芥原生質體中成功表達；鐘英健等[11]利用分離出的大量水稻原生質體進行了OsVDAC2基因的瞬時表達和亞細胞定位。同時,原生質體在細胞融合和植株再生上的研究也有大量報道,孫振久等[12]研究了甘藍和蘿卜原生質體融合,梁丹等[13]研究了甘藍和大白菜原生質體融合,李貴等[14]對結球甘藍下胚軸原生質體進行培養并獲得再生植株。此外,Murovec等[15]利用分離純化的蕪菁原生質體,驗證CRISPR-Cas9系統中sgRNA靶向能力。

盡管甘藍原生質體的分離及其細胞融合和植株再生上的應用研究已經有報道,但是甘藍原生質體的轉化體系等相關研究較少,本研究在前人研究的基礎上,從甘藍原生質體分離過程中酶解時間、甘露醇濃度、離心力大小和不同外植體因素著手,利用正交設計優化原生質體的分離條件,分析其對原生質體產量及活力的影響,并對甘藍下胚軸、子葉、葉球分離的原生質體進行了瞬時轉化試驗,比較不同外植體分離獲得的原生質體的轉化效率,建立了甘藍高效的原生質體制備和轉化體系,同時利用該轉化體系對載體CRISPR/Cas9基因編輯載體PBSE401-BoPDS的sgRNA靶向能力進行了檢測,為甘藍細胞融合、遺傳轉化、亞細胞定位、蛋白互作、基因編輯等研究提供技術平臺。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 品種及載體 由北京市農林科學院蔬菜研究中心甘藍課題提供甘藍732品種和載體COX和969,載體pCBC-DT1T2和PBSE401由中國農業大學陳其軍教授饋贈,以甘藍葉球和培養13 d的無菌黃化苗的下胚軸、子葉為材料。

1.1.2 試劑 纖維素酶(Cellulase-R10)和離析酶(Macerozyme-R10)均為日本Yakult進口分裝,甘露醇、牛血清蛋白(BSA)、二乙酸熒光素(FDA)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、B5、蔗糖、植物凝膠均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗培養 先用流水將甘藍種子沖洗10～20 min,然后將種子置于無菌50 mL離心管中并加入75%酒精消毒30 s,接著將種子放入8%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,浸泡過程中不斷搖晃,使種子表面得到充分消毒,再用無菌水沖洗4～6次,接種于種子萌發培養基(3.2 g/L B5+20 g/L蔗糖+4 g/L植物凝膠,pH值5.7),每個培養基接種20粒種子,組培室室溫黑暗培養13 d。

1.2.2 正交設計 本試驗在前人研究的基礎上,選取裂解酶組合為1%纖維素酶和0.5%離析酶,將甘露醇濃度、酶解時間、離心速度、不同外植體作為正交試驗考察的主要因素,以分離得到的原生質體數量和活力為考察指標,進行4因素3水平L9(34)正交試驗(表1)。

表1 正交試驗設計Tab.1 Orthogonal design of the test

1.2.3 原生質體制備 將甘藍葉球和無菌苗的子葉、下胚軸作為外植體,各稱取15 g,切成約1～2 mm的小碎塊,分別移入15 mL的酶解液中(1%纖維素酶+0.5%離析酶+甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl2+0.1% BSA+5 mmol/L β-巰基乙醇),在黑暗、26 ℃、60 r/min條件下進行振蕩酶解,酶解結束后,用50 μm細胞篩過濾除去較大組織碎塊,濾液轉至10 mL圓底離心管,室溫離心5 min收集原生質體,除去上清液。加入3 mL W5(154 mmol/L NaCl+125 mmol/L CaCl2+ 5 mmol/L KCl+5 mmol/L 葡萄糖+2 mmol/L MES)溶液清洗原生質體3次,離心棄上清,加入1 mL W5溶液重懸,即可獲得純化的原生質體。接著對原生質體活力和產量進行測定,原生質體活力測定參照張鐘仁等[16]方法,用0.01%二乙酸熒光素(FDA)染色,在熒光顯微鏡上統計一個視野中發綠色熒光的原生質體數與原生質體總數的比值,計算出原生質體活力。原生質體的產量測定參照張金鵬等[17]方法,取少量原生質體懸浮液滴加在0.1 mm血球計數板上,在顯微鏡下觀察和統計血球計數板大方格內的原生質體個數,然后按照以下公式計算出原生質體產量。原生質體產量(個/g FW)=計數板大方格內(0.1 mm3)的原生質體數×104×原生質體懸浮液總體積/制備原生質體所用材料鮮質量。

1.2.4 原生質體轉化 將純化后的100 μL原生質體冰浴10 min,然后加入1 μg PYBA 1132質粒中,再加入110 μL 20% PEG4000,混勻后室溫黑暗放置10 min,后加入440 μL的W5溶液稀釋轉化混合液,然后輕柔上下顛倒離心管,使之混合均勻以終止轉化反應。1 890 r/min離心3 min,去除上清,加入600 μL W5溶液,放置20 ℃恒溫培養箱黑暗培養24 h。在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察原生質體中GFP表達情況[18]。選取3個有代表性的視野進行統計,取平均值,按照以下公式計算轉化率。原生質體轉化效率=(激發光下發出綠色熒光的原生質體數/明場下所有原生質體數)×100%。

1.2.5 靶位點的選擇 基于甘藍八氫番茄紅素脫氫酶基因BoPDS(Gene ID：Bo4g127210,Ensembl Genomes數據庫)序列,在網站http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/上選擇甘藍PDS基因特異靶點并設計引物。靶位點的GC含量不低于40%,為防止發生脫靶效應該盡量減少sgRNA與預測的脫靶位點序列的配對堿基數,同時預測的脫靶位點與設計的sgRNA在靠近PAM區保證至少有2個堿基不配對。最后,連續的或間隔的4個堿基配對不能出現在sgRNA與預測的脫靶位點序列中。

1.2.6 CRISPR/Cas9表達載體PBSE401-BoPDS的構建 以pCBC-DT1T2載體為模板,利用BoPDS-DT1-BsF、BoPDS-DT1-BsR、BoPDS-DT1-F0和BoPDS-DT1-R02對引物(表2)進行PCR擴增,回收PCR產物,將PCR產物與PBSE401載體按以下比例加入酶切連接體系(2 μL PCR產物、2 μL PBSE401載體、1.5 μL 10×NEB T4Buffer、1.5 μL 10×BSA、1 μLBsaⅠ、1 μL T4連接酶、6 μL ddH2O),37 ℃條件下反應5 h,50 ℃條件下反應5 min,80 ℃條件下反應10 min完成酶切連接。將連接產物導入大腸桿菌感受態Trans1-T1,涂布于含有卡那霉素的LB平板,37 ℃培養過夜,挑選陽性克隆,并用載體特異性引物U626-F和U629-R(表2)進行PCR驗證,構建成具有雙靶點的PBSE401-BoPDS載體。

2 結果與分析

2.1 最優組合的確定

以原生質體分離數量和活力為指標,進行正交分析得出極差,對各因素進行分析,計算結果如表3所示。根據正交試驗結果與極差分析可知,各因素對原生質體分離的數量作用主次為：甘露醇濃度(R)>酶解時間(R)>離心速度(R)>不同外植體(R),各因素對原生質體活力作用主次為：甘露醇濃度(R′)>酶解時間(R′)>離心速度(R′)>不同外植體(R′),說明甘露醇濃度和酶解時間對原生質體數量和活力影響較大,離心速度和不同外植體對原生質體數量和活力影響較小。

表2 引物名稱與序列Tab.2 The primer names and sequences

表3 正交試驗結果與極差分析Tab.3 Orthogonal experimental results and range analysis

注：Ki為任意列的水平為i時對應的試驗結果的和；ki為任意列水平為i時對應的試驗結果的平均值；R.極差。

Note：Kiindicates sum of corresponding test results ofilevel; kiindicates average of corresponding test results ofilevel; R. Range.

進一步對各因素各水平間的處理結果進行LSD多重比較分析顯示,甘露醇作為滲透壓穩定劑,過高或過低均會對原生質體數量和活力產生影響,當甘露醇濃度達到0.6 mol/L時,分離得到的原生質體數量和活力均為最好,顯著高于其他2組(圖1)；由圖2所示,隨著酶解時間的增加,分離得到的原生質體數量和活力也隨之增加,酶解6 h后達到最佳,繼續增加酶解時間(8 h),原生質體產量和活力均下降,表明過長的酶解時間對原生質體分離有一定負作用,會造成部分原生質體破裂。因此,在本試驗中最佳的酶解時間是6 h(圖2)；通過對離心速度進行945,2 115,2 675 r/min的梯度設置,研究了離心速度對原生質體產量和活力的影響,結果表明，隨著離心速度的增加,原生質體產量和活力均先增加后降低,在2 115 r/min時均達到最大值(圖3)；分別以甘藍子葉、下胚軸和葉球為材料,分析了不同外植體對原生質體產量和活力的影響,由圖4可知不同外植體分離獲得的原生質體數量和活力均無顯著差異,這與極差較小的結果一致,說明不同外植體對原生質體數量和活力影響較小,其中下胚軸分離獲得的原生質體產量和活力均為最高,表明以下胚軸為材料進行原生質體制備效果最佳。綜上所述,原生質體制備的最佳條件為：以甘藍下胚軸為外植體,酶液組成為1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.6 mol/L 甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl2+0.1% BSA+5 mmol/L β-巰基乙醇,26 ℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min離心5 min收集細胞。

圖1 甘露醇各水平的產量和活力均值LSD比較Fig.1 LSD comparison of average yield and vitality at each mannitol level

圖2 酶解時間各水平的產量和活力均值LSD比較Fig.2 LSD comparison of average yield and vitality at each time level

2.2 優化條件下原生質體制備

圖3 離心速度各水平的產量和活力均值LSD比較Fig.3 LSD comparison of average yield and vitality at each centrifugal speed level

圖4 外植體各水平的產量和活力均值LSD比較Fig.4 LSD comparison of average yield and vitality at each explant level

通過四因素三水平的正交試驗設計,獲得了影響原生質體制備的4個因素的最佳組合,因試驗設計中沒有最佳組合,故對試驗結果進行驗證,以甘藍下胚軸為外植體,在含有0.6 mol/L甘露醇的酶解液中黑暗酶解6 h,以2 115 r/min的離心速度收集細胞,對分離獲得的原生質體數量和活力進行統計(圖5),結果顯示在最優組合條件下獲得的原生質體數量可達3.0×106個/g,活力約為90.9%。

圖5 最佳條件下分離獲得的原生質體形態和活力Fig.5 Protoplasts morphology and vitality under optimal conditions

2.3 甘藍原生質體瞬時轉化體系建立

研究分別以甘藍下胚軸、子葉、葉球分離純化的原生質體作為受體,以植物瞬時表達載體PYBA 1132質粒作為目標DNA,利用PEG介導法進行轉化試驗,研究了不同外植體對原生質體轉化效率的影響。本試驗結果顯示下胚軸、子葉、葉球分離獲得的部分原生質體,用PEG介導法轉化后,在488 nm激發光下觀察到GFP綠色熒光信號,且在細胞膜和細胞核上均有分布,甘藍下胚軸分離獲得的原生質體轉化效率最高(43%,圖6-A、B),甘藍子葉分離獲得的原生質體轉化效率為35%(圖6-C、D),甘藍葉球分離獲得的原生質體轉化效率最低,僅為19%(圖6-E、F)。同時以下胚軸分離獲得的原生質體為受體,對細胞器特異定位載體進行了表達分析；分別轉化線粒體特異表達載體COX和質體特異表達載體969,在激光共聚焦顯微鏡下都觀察到GFP綠色熒光信號(圖7),表明利用原生質體瞬時轉化體系成功對載體COX和載體969進行了亞細胞定位。以上結果表明,成功建立了甘藍原生質體瞬時轉化體系。

2.4 靶位點的選擇及載體構建

A，B.下胚軸原生質體GFP熒光和明場；C，D.子葉原生質體GFP熒光和明場；E，F.葉球原生質體GFP熒光和明場。A,B.GFP filter and bright field of protoplasts from hypocotyls; C,D.GFP filter and bright field of protoplasts from cotyledons; E, F.GFP filter and bright field of protoplasts from heads leaves.

A，C.GFP熒光；B，D.明場。A,C.GFP filter; B,D.Bright field.

根據甘藍BoPDS基因序列,設計位于BoPDS第1個外顯子和第2個外顯子上具有PAM序列的2個靶位點(Target1：TAAGACAAGAACAAGGCGA和Target2：AGTGTGTGTGGACATACCA)(圖8-A),GC含量分別為40%和45%。根據靶點序列合成接頭引物BoPDS-DT1-BsF、BoPDS-DT1-F0、BoPDS-DT1-R0和BoPDS-DT1-BsR(表2),進行PCR擴增,回收產物構建到CRISPR/Cas9載體PBSE401上,使用引物U626-F和U629-R進行檢測,連接成功的載體PCR擴增產物約728 bp,構建成雙靶點載體PBSE401-BoPDS(圖8-B)。

2.5 甘藍原生質體瞬時轉化檢測BoPDS的突變

通過PEG介導的甘藍原生質體轉染進行CRISPR/Cas9基因編輯載體的瞬時表達驗證。將構建好的包含打靶位點BoPDS的CRISPR/Cas9載體瞬時轉化甘藍原生質體,對載體PBSE401-BoPDS的靶向編輯能力進行檢測,以提取出轉染24 h后的原生質體基因組DNA為模板,以跨越靶位點的特異性引物如表2所示(BoPDSdetection primer-F/BoPDSdetection primer-R)進行PCR擴增,獲得目的片段,連接T克隆載體,挑選24個陽性克隆進行測序,結果表明：被轉化的原生質體基因組DNA存在基因編輯,編輯類型有堿基替換和堿基插入,靶點1的PAM序列后第7個堿基處發生替換,由T堿基變為G堿基(圖9)；靶點2附近有2種堿基插入類型,第1種是PAM序列前面有一個T堿基插入,第2種是PAM序列前面第3位和第6位出現了2個堿基插入(圖9)。24個陽性克隆中3個發生編輯,編輯效率為12.5%,表明利用甘藍原生質體瞬時轉化體系,對甘藍CRISPR/Cas9基因編輯進行了初步研究,為后期甘藍基因編輯及新種質創制提供技術平臺。

圖8 靶位點選擇(A)和pBSE401-BoPDST-DNA區域(B)示意圖Fig.8 Schematic representation of BoPDS with target site (A) and the T-DNA region of the pBSE401-BoPDS vector (B)

加下劃線的堿基代表插入的堿基或發生替換的堿基。The underline letters represent the inserted or substituted bases.

2.6 氨基酸序列分析

在獲得的3個基因突變的樣品序列中,進一步使用DNAMAN對這3個樣品BoPDS編碼的氨基酸序列進行預測分析,1號樣品發生了1個堿基T的插入,使其在第36氨基酸突變為終止信號,翻譯提前終止；2號樣品發生了2個堿基G和A的插入,使其在第40位氨基酸突變為終止信號,翻譯也提前終止；3號樣品有一個堿基T突變為堿基G,使得其在第25位氨基酸由半胱氨酸變為甘氨酸(圖10)。這些結果表明，本研究獲得的原生質體基因組編輯樣品中,BoPDS基因編碼的氨基酸存在不同程度的變異,為在甘藍上創制基因敲除植株奠定基礎。

圖10 野生型和基因組編輯的BoPDS序列的氨基酸序列預測Fig.10 Predicted amino acids of wild type and genome-edited BoPDS sequences

3 結論與討論

原生質體的瞬時表達體系在現代分子生物學和細胞生物學發揮著重要的功能,被廣泛地應用于亞細胞定位、蛋白互作、轉錄因子活性檢測和基因編輯等分子生物學試驗[19]。由于原生質體失去了細胞壁這一屏障,因而使其具有特殊的優點,當使用原生質體作為受體時,外源基因更易于轉化,經培養、選擇和分化后,便可以獲得基因工程植株[20]。因此,對甘藍原生質體制備與轉化體系的研究,為甘藍基因功能分析和新種質創制提供技術平臺。

在原生質體制備過程中,多種因素可以影響原生質體產量和活力,例如酶解液的滲透壓、酶解時間、純化時的離心速度、不同外植體等。本研究利用正交試驗對影響原生質體產量和活力的4個因素進行不同組合,對甘藍原生質體制備體系進行了優化。酶解液的滲透壓是影響原生質體分離的重要因素,滲透劑維持一定的滲透壓,使細胞處于質壁分離狀態,不致膨脹破裂。大多數研究使用0.3～0.8 mol/L的甘露醇來調節滲透壓,如柳枝稷葉肉細胞和葡萄葉片原生質體分離時,使用的甘露醇濃度都為0.6 mol/L[21-22]。本研究使用0.6 mol/L甘露醇時效果最佳,0.8 mol/L時原生質體產量和活力下降。酶解時間是另一個獲得高質量原生質體的重要條件,在其他條件相同的情況下,酶解時間越長,質膜越易受到損傷,雖然原生質體的產量變高,但破碎的細胞也隨之增多,影響后續的試驗,所以應控制酶解時間,以求在較短的時間內獲得較多的原生質體。周波等[23]在研究蕪菁原生質體分離及瞬時表達時酶解時間為18 h,本研究中分離原生質體的最佳酶解時間為6 h。由于原生質體沒有細胞壁的保護,很容易發生破裂,因此離心速度將直接影響原生質的產量,適宜的離心速度不僅能保證原生質體不被外力所破壞,同時還能最大程度地得到高質量的原生質體。本研究中最適宜的收集原生質體的離心速度為2 115 r/min。不同外植體分離獲得的原生質體產量和活力不同,在本研究使用的3種外植體中,下胚軸分離獲得的原生質體產量和活力最高,這可能與不同組織部位的狀態有關系；此外,下胚軸游離的原生質體生長速度快、褐化程度低、分裂頻率高且無葉綠體等細胞器干擾,易于進行轉化和亞細胞定位等試驗[24-25]。本研究在獲得的最佳組合條件下進行原生質體制備,分離獲得的原生質體產量可達約為3.0×106個/g,活力約為90.9%,完全能夠滿足后續試驗要求。

甘藍原生質體的制備有較多的研究報道,但是對原生質體轉化體系的研究相對較少。目前,原生質體的轉化方法有農桿菌轉化法、顯微注射法及PEG介導轉化法等。PEG介導轉化法具有成本低、操作簡便以及省時高效等優點而得到廣泛應用[26]。本研究在20%的PEG介導下,將PYBA 1132載體分別與甘藍下胚軸、子葉、葉球分離獲得的原生質體孵育10 min,進行瞬時轉化,均可檢測到高活性綠色熒光,轉化效率分別為43%,35%,19%,其中下胚軸分離獲得的原生質體轉化效率最高,同時也成功轉化了線粒體與質體特異定位載體,進一步證明了該體系制備的原生質體應用于瞬時表達分析的可行性。本試驗只對原生質體瞬時轉化進行了初步摸索,還有很多因素影響原生質體的轉化效率,比如載體大小、DNA濃度、PEG種類等[27],因此,該轉化體系仍有很大的優化空間。

植物原生質體瞬時表達系統是一種快速的、高通量、轉化簡單的分析系統,也被廣泛應用于CRISPR/Cas9基因編輯的研究中。已有研究報道,在一些遺傳轉化效率低的植物中,利用原生質體瞬時轉化體系,對CRISPR/Cas9基因編輯系統的可行性進行快速評估。例如郭曄等[28]利用葡萄原生質體瞬時轉化體系,對構建的CRISPR/Cas9表達載體的sgRNA靶向能力進行了檢測,后對葡萄胚性愈傷組織進行遺傳轉化,成功獲得葡萄VviPDS1基因敲除植株。張文靜等[29]利用蒙古冰草原生質體瞬時轉化體系,靶向敲除蒙古冰草落粒相關基因Sh1,為蒙古冰草CRISPR/Cas9基因編輯系統提供了試驗依據。李繼洋等[30]利用海島棉原生質體轉化體系,比較分析CRISPR/Cas9表達載體的編輯效率和脫靶效應的差異,為優化CRISPR/Cas9介導的海島棉基因組編輯體系奠定了重要的理論依據。史奇奇等[31]構建CRISPR/Cas9表達載體pCas9-miR394,在紅麻葉片原生質體中進行瞬時表達,發現設計的2個靶點在原生質體中都具有靶向切割活性。此外,Tian等[32]利用PEG介導的原生質體轉化方法測試靶點特異性與效率,隨后利用農桿菌介導法轉化西瓜子葉建立西瓜穩定CRISPR/Cas9基因編輯體系。在蕓薹屬作物中,Lin等[33]利用原生質體轉化體系,對菜花和油菜的GA4.a基因進行編輯,獲得了穩定的基因編輯植株。然而,利用甘藍原生質體檢測CRISPR/Cas9系統中的sgRNA的靶向能力的研究還鮮有報道,同時甘藍遺傳轉化周期長,遺傳轉化過程復雜且效率較低,因此,在甘藍原生質體中評估CRISPR/Cas9載體靶向編輯效率,對于在穩定轉化的甘藍中實現成功的基因組編輯至關重要。本研究中通過PEG介導CRISPR/Cas9質粒瞬時轉染甘藍原生質體細胞后,通過測序的方法檢測到了CRISPR/Cas9系統可在甘藍原生質體細胞中進行基因編輯,獲得堿基替換和堿基插入這2種基因編輯類型,受到編輯的BoPDS基因序列編碼的氨基酸存在不同程度的變異,為創制甘藍基因突變體奠定了基礎。該方法則相對簡單、快捷和成本低,且分離原生質體的材料豐富,可用于大量靶點切割能力的驗證。利用原生質體瞬時轉化系統,對甘藍基因編輯進行了一個初步研究,對靶點切割能力的檢測,評估靶點的特異性及效率,有利于后期應用于甘藍穩定的CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立,也為今后甘藍基因編輯技術的應用奠定了基礎。

綜上所述,本研究利用正交試驗對甘藍原生質體制備體系進行了優化,建立了PEG介導的甘藍原生質體瞬時轉化體系,并利用該體系對CRISPR/Cas9表達載體PBSE401-BoPDS的sgRNA靶向能力進行了檢測,獲得了基因編輯的原生質體細胞,以上結果為甘藍基因的亞細胞定位、功能分析以及穩定的基因編輯技術的利用等奠定了基礎。