山羊APOE基因克隆及組織細(xì)胞表達(dá)模式分析

杜 宇,王 永,張亞楠,許 晴,朱江江,林亞秋

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部,四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

載脂蛋白(Apolipoprotein)是血漿中不溶于水可以與脂質(zhì)結(jié)合參與脂類在血漿中轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白有20多種,按其組成分為APOA、B、C、D、E、H、M等[2]。其中在血漿中幾乎與所有的脂蛋白顆粒相關(guān)的載脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)是一種多態(tài)性蛋白,主要呈現(xiàn)3種同種型：E2、E3和E4,它們是單個基因位點(diǎn)上3個等位基因(ε2、ε3和ε4)的產(chǎn)物[3],APOE主要存在于大部分來源于肝細(xì)胞的乳糜微粒(Chylomicron,CM)、極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)和部分高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)中,其他外周來源有巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等,APOE既可以與低密度脂蛋白家族成員結(jié)合,也可與硫酸肝素蛋白聚糖結(jié)合,是影響脂代謝的重要遺傳因素之一[4-6]。研究表明，APOE在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用,主要可總結(jié)為以下幾個方面：①APOE在循環(huán)脂蛋白中起到脂蛋白攝取的配體作用,例如APOE對LDL受體家族成員的高親和力可促進(jìn)肝臟和肝外血漿脂蛋白的攝取,HDL調(diào)控動脈粥樣硬化的功能可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇的去除,因而APOE-/-小鼠已成為研究實(shí)驗(yàn)性小鼠動脈粥樣硬化的優(yōu)選模型[7-10]；②APOE是甘油三酯(Triglycerides,TG)分解代謝的限速酶,能從血液中清除富含TG的VLDL和CM[11]；③王艷梅等[12]研究發(fā)現(xiàn),APOE基因的多態(tài)性與2型糖尿病周圍神經(jīng)病變有很大的相關(guān)性；④APOE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system CNS)脂質(zhì)代謝的主要載脂蛋白之一[13],其基因型對腦脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響可能是與APOE相關(guān)的阿爾茲海默病(Alzheimer disease,AD)風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ),并且APOE、APOA與CNS脂蛋白的脂質(zhì)外排和遞送功能有關(guān)[14]。以上關(guān)于人類疾病的研究均證明APOE基因在脂代謝中的重要作用,但APOE基因在反芻動物脂肪方面的研究尚未見報(bào)道,目前僅見GenBank上山羊APOE基因的預(yù)測序列,其序列的分子特征、組織表達(dá)規(guī)律及在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)模式還不清楚,而闡明上述這些問題是最終揭示山羊APOE基因功能的重要基礎(chǔ)。

因此,本試驗(yàn)首先利用RT-PCR及3′ RACE方法克隆山羊APOE基因序列,在獲得基因序列基礎(chǔ)上利用qPCR方法檢測該基因在山羊各組織和皮下前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式,獲得其組織和細(xì)胞表達(dá)譜。研究結(jié)果為闡明APOE基因在山羊代謝和脂肪細(xì)胞分化中的作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品采集 本試驗(yàn)所用組織采自于四川省簡陽大哥大牧業(yè)有限公司的1周歲健康大耳羊(Caprahircus)(n=4),清晨空腹屠宰放血后立即取其各個內(nèi)臟和肌肉等組織,用已滅菌的DEPC水處理組織后再用滅過菌的錫箔紙包裹組織樣品,迅速將樣品置于凍存管中,標(biāo)記好后于液氮中儲存。

1.1.2 試驗(yàn)材料 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司。I-5TM2×High-Fidelity Master Mix、TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞和pClone007 Versatile Simple Vector Kit購自擎科梓熙生物技術(shù)有限公司,膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。3′-Full RACE Core Set、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ和TRIzol均購自TaKaRa公司,DEPC購自Sigma公司,血清購自Gemini公司,胰蛋白酶和DEME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司,油酸購自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊APOE基因克隆 以山羊肺臟組織為模板,利用TRIzol法提取總RNA,以1 μg RNA為模板合成cDNA,保存于-20 ℃。根據(jù)GenBank中牛(登錄號：XM_005219148.4)的APOE基因預(yù)測序列,利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)克隆引物(表1),RT-PCR反應(yīng)總體系：I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL,模板cDNA 1 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,ddH2O 9.5 μL。RT-PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 10 s，退火61 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 5 min，變性至第1個延伸過程進(jìn)行35個循環(huán)。利用膠回收試劑盒收獲片段,連接到pClone007 Versatile Simple Vector載體后轉(zhuǎn)化于TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)10～12 h后挑取單菌落于干凈的EP管中,加入含AMP的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h,進(jìn)行菌液PCR鑒定,將符合預(yù)期片段的菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。APOE基因3′UTR克隆根據(jù)3′-Full RACE Core Set試劑盒說明書,利用Primer premir 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)；按照說明書中使用實(shí)驗(yàn)樣品RNA時的操作方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、套氏PCR反應(yīng)等步驟。套氏PCR采用擴(kuò)增條件：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 10 s，退火61 ℃ 15 s， 延伸72 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 5 min，變性至第1個延伸過程進(jìn)行30個循環(huán)。同上述克隆后續(xù)步驟,符合預(yù)期片段的菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 克隆和熒光定量PCR引物信息Tab.1 Primers informations for reverse transcription PCR (RT-PCR) and quantitative Real-time PCR(qPCR)

注：S.正義鏈引物；A.反義鏈引物；UXT.廣泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子基因。

Note：S.Sense primer；A.Antisense primer；UXT.Ubiquitously-expressed transcript gene.

1.2.2 山羊APOE的生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列相似性比對；ExPASy ProtParam數(shù)據(jù)庫推導(dǎo)APOE蛋白基本理化性質(zhì)；利用NCBI中Conserved Domains預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域；Blast進(jìn)行同源性分析；磷酸化位點(diǎn)、O糖基化位點(diǎn)和N糖基化位點(diǎn)分別由NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0預(yù)測；TMHMM預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域,SignalIP 4.1預(yù)測信號肽；使用NPSA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；蛋白三級結(jié)構(gòu)使用Swiss-model進(jìn)行預(yù)測分析；PSORT Ⅱ進(jìn)行亞細(xì)胞定位；使用Mega 7.0軟件,鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；利用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶標(biāo)APOE基因的miRNA；利用Mirbase數(shù)據(jù)庫查找miRNA序列。

1.2.3 山羊APOE基因組織表達(dá)模式分析 采用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)方法,檢測該基因在山羊13種組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、大腸、小腸、皮下脂肪、腹部脂肪、瘤胃)中的表達(dá)水平,根據(jù)克隆所得CDS區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異引物(表1)。qPCR反應(yīng)體系：正向引物1 μL(10 μmol/L)、反向引物 1 μL(10 μmol/L)、cDNA 1 μL、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL、ddH2O 7 μL。qPCR運(yùn)行程序：預(yù)變性：95 ℃ 3 min;變性：95 ℃ 10 s,退火(APOE：62 ℃,UXT：60 ℃)10 s,延伸72 ℃ 15 s,38個循環(huán)。

1.2.4APOE基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式 取出凍存的山羊皮下脂肪細(xì)胞,37 ℃水浴鍋復(fù)蘇細(xì)胞后,與含有10%胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)基混合制成細(xì)胞懸液,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2 d換液進(jìn)行傳代培養(yǎng),F3細(xì)胞傳置12孔板,待細(xì)胞鋪板到80%時換油酸誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,分別在誘導(dǎo)0～96 h后加TRIzol收細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA,利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞cDNA,采用qPCR方法檢測山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化不同時間段APOE基因的表達(dá)情況。qPCR引物、內(nèi)參和反應(yīng)條件同1.2.3。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 組織表達(dá)與細(xì)胞時序表達(dá)均選擇UXT做內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法分析qPCR數(shù)據(jù)。利用SPSS 18.0中LSD法與Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,使用GraphPad Prism 5繪制組織與時序表達(dá)譜,參照LSD與Duncan法分析結(jié)果對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊APOE基因克隆

以山羊肺臟組織cDNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增獲得山羊APOE基因序列970 bp(圖1-A),其中包括ORF 951 bp,5′端7 bp,3′UTR區(qū)12 bp；3′RACE獲得山羊3′UTR 152 bp；編碼316個氨基酸(圖1-B)。提交GenBank獲得登錄號MN049956與MN049957；Conserved Domains結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)山羊APOE蛋白具有載脂蛋白家族典型結(jié)構(gòu)域(圖1-C)。

M.DL2000 DNA Marker；1.APOE基因；信號肽剪切位點(diǎn)用方框表示；結(jié)構(gòu)域用灰色底紋表示；*.終止密碼子。A.山羊APOE基因擴(kuò)增；B.山羊APOE基因核苷酸及推測的氨基酸序列；C.APOE蛋白質(zhì)生物學(xué)功能預(yù)測。

M.DL2000 DNA Marker；1.APOEgene；Signal peptide cleavage site is indicated by the box；Domains are indicated by grey shading；*.The stop codon.A.Amplification ofAPOEgene inCaprahircus；B.The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence ofAPOEin goat；C.Prediction of biological function of APOE protein.

圖1 山羊APOE基因克隆與結(jié)構(gòu)域預(yù)測
Fig.1 Cloning and domain prediction ofAPOEin goat

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)分析 使用ProtParam、SignalIP 4.1、NetPhos 3.1、和TMHMM等在線預(yù)測軟件預(yù)測山羊APOE蛋白的基本理化性質(zhì),預(yù)測結(jié)果見表2。

表2 山羊APOE基本理化性質(zhì)Tab.2 Basic physicochemical properties of goat APOE

2.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)特征互作及靶標(biāo)miRNA預(yù)測 NPSA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,255(80.70 %)個氨基酸可能形成α螺旋(h),51(16.14 %)個氨基酸可能形成無規(guī)卷曲(c),10(3.16 %)個氨基酸可能形成延伸鏈(e)(圖2-A)；Swiss-model預(yù)測山羊APOE蛋白三級結(jié)構(gòu)(圖2-B)；利用STRING進(jìn)行蛋白互作分析構(gòu)建蛋白互作網(wǎng),發(fā)現(xiàn)APOE蛋白可能和APOB、APOA1、SCARB1、APP、LPL、LRP2、LRP1和LDLR等蛋白存在相互作用,構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)(圖2-C)；在Targetscan的牛數(shù)據(jù)庫低保守的脊椎動物中預(yù)測發(fā)現(xiàn)可能靶標(biāo)APOE基因的miR-22-3p(圖2-D)；Mirbase數(shù)據(jù)庫查到chi-miR-22-3p,登錄號：MIMAT0036076。

A.山羊APOE蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.山羊APOE蛋白三級結(jié)構(gòu)；C.山羊APOE蛋白相互作用分析；D.APOE基因miRNA預(yù)測。A.Prediction of APOE protein secondary structure in goats；B.Goat APOE protein tertiary structure；C.Interaction analysis in APOE protein of goat；D.Prediction of APOE gene miRNA.

2.3 APOE系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

本試驗(yàn)山羊APOE核苷酸和氨基酸序列比對結(jié)果見圖3-A,山羊APOE基因核苷酸序列與綿羊、藏羚羊和牛的序列相似性較高,分別為98.42%,97.78%和92.05%。根據(jù)所選擇的不同物種的APOE氨基酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3-B),由進(jìn)化樹可見，山羊與綿羊在同一分支親緣關(guān)系最近,符合物種進(jìn)化規(guī)律。試驗(yàn)引用序列均來自GenBank數(shù)據(jù)庫。

A.不同物種APOE蛋白相似性分析；B.不同物種間APOE氨基酸的進(jìn)化樹。A.Similarity of APOE protein between different species；B.Phylogenetic tree of APOE of various species.

2.4 山羊APOE基因組織表達(dá)譜構(gòu)建

qPCR檢測APOE基因在1周歲簡州大耳山羊不同組織中的表達(dá)情況(圖4),以UXT為內(nèi)參基因,心臟表達(dá)水平做對照來分析試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果顯示APOE基因在皮下脂肪表達(dá)量最高,極顯著高于其他組織(P<0.01)。

2.5 山羊APOE基因細(xì)胞時序表達(dá)譜構(gòu)建

基于APOE基因的組織表達(dá)譜得知其在脂肪組織中高表達(dá),為了探究APOE基因在脂肪沉積中發(fā)揮的作用,本試驗(yàn)選擇山羊皮下前體脂肪細(xì)胞為檢測對象,分別在誘導(dǎo)分化0～96 h檢測APOE的表達(dá)水平,以UXT基因?yàn)閰⒄栈蚍治鲈囼?yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示,APOE基因在皮下前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)量較高,在誘導(dǎo)分化60 h時表達(dá)量達(dá)到峰值,顯著高于未分化前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.05)(圖5)。

以心臟表達(dá)水平為對照,UXT為內(nèi)參基因。不同字母表示組織間差異極顯著(P<0.01)。

The expression level of the heart tissue was used as control,UXTwas used as internal reference. The different letters indicated the extremely significant difference of each tissue(P<0.01).

圖4APOE在山羊不同組織中的相對表達(dá)水平
Fig.4 The tissues expression ofAPOEin goat

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters indicated the significant difference(P<0.05).

3 討論與結(jié)論

載脂蛋白E(Apolipoprotein E, APOE)是血漿脂蛋白的重要組成成分,血漿脂蛋白包括極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、中間密度脂蛋白(IDL)和乳糜微粒(CM)。相關(guān)研究表明,APOE主要存在于VLDL中并且在CM和HDL中也含有少量,APOE的主要功能是與脂蛋白、LDL-R和HSPG(包括肝素)相互作用從而介導(dǎo)CM、VLDL及其殘粒在循環(huán)系統(tǒng)中的清除[15-16]。近年來研究發(fā)現(xiàn),APOE基因缺失糖尿病小鼠可能出現(xiàn)胰島素抵抗,導(dǎo)致糖尿病小鼠血脂代謝進(jìn)一步紊亂[17-18]。因此,關(guān)于其在脂代謝中的作用受到學(xué)者的廣泛關(guān)注,但關(guān)于該基因在山羊脂肪沉積和脂代謝方面尚未見報(bào)道。本研究基于NCBI上APOE基因的預(yù)測序列克隆得到山羊APOE基因序列970 bp,通過在線數(shù)據(jù)庫對山羊APOE進(jìn)行生物信息學(xué)分析,山羊APOE編碼316個氨基酸,蛋白預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個不穩(wěn)定的酸性蛋白；并利用STRING預(yù)測軟件分析蛋白相互作用得知APOE與載脂蛋白B(APOB)、血清載脂蛋白A1(APOA1)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)、淀粉樣前體蛋白(APP)、低密度脂蛋白受體(LDLR)和脂蛋白脂酶(LPL)等蛋白存在相互作用,而以上蛋白均與脂代謝與脂肪沉積密切相關(guān)[19-24]。有研究證明,APOE可以和低密度脂蛋白受體(LDLR)和LDLR相關(guān)蛋白結(jié)合而促進(jìn)脂蛋白顆粒的細(xì)胞攝取,并且APOE的3個等位基因E2、E3和E4的氨基酸序列不同會導(dǎo)致受體結(jié)合親和力功能差異,即E2等位基因的氨基酸序列比E3和E4等位基因的結(jié)合親和力低,導(dǎo)致肝臟VLDL和乳糜微粒殘留物清除率降低,從而減少餐后脂蛋白顆粒的攝取[25-27]。Cheng等[28]在APOE-|-小鼠中研究miR-182與脂質(zhì)水平之間的潛在關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn),在miR-182 agomir處理組,腹膜巨噬細(xì)胞中表達(dá)LPL mRNA和蛋白質(zhì)顯著增加,并且APOE-|-小鼠的血漿TC水平顯著升高,血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度升高,但降低了血漿TG濃度。本研究在Targetscan牛數(shù)據(jù)庫的低保守脊椎動物中預(yù)測到可能靶標(biāo)APOE基因的miR-22-3p,并在Mirbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)存在chi-miR-22-3p,de Gonzalo-Calvo等[29]研究心外膜脂肪量(Epicardial fat volume,EFV)發(fā)現(xiàn)血漿miR-22-3p與EFV直接相關(guān),并且高EFV患者血漿miR-22-3p表達(dá)水平顯著高于底EFV患者,此外Colom等[30]針對Ⅰ型糖尿病(T1DM)研究,分析心外膜脂肪組織(Epicardial adipose tissue,EAT)與HDL成分之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),EAT指數(shù)(iEAT)越高小HDL(HDL3)的比例越高,并且HDL中APOC-Ⅲ和APOA-Ⅱ的含量與iEAT呈正相關(guān),而與ApoE含量為負(fù)相關(guān)。

為了進(jìn)一步闡明山羊APOE基因的功能,本研究明確了其組織表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在皮下脂肪中的表達(dá)量極高,Hamlin等[31]報(bào)道APOE主要通過結(jié)合肝臟及肝外組織APOE.B100受體介導(dǎo)脂蛋白代謝。因APOE基因在山羊皮下脂肪組織中存在高水平表達(dá),推測該基因與脂肪沉積有關(guān),為了進(jìn)一步證實(shí)這個想法,本研究利用qPCR方法明確了該基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化前后的表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因隨著脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行呈上升趨勢,且在60 h時表達(dá)水平最高。推測APOE可能具有促進(jìn)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的作用。姜紅等[15]研究發(fā)現(xiàn),在APOE敲除小鼠中,APOE缺失會使內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)基因表達(dá)增加,而Visfatin是重要的脂肪細(xì)胞因子。且Li等[32]指出,Visfatin融合蛋白可通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、aP2、C/EBPα和FAS的表達(dá)來促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。但APOE基因在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化中到底扮演著什么角色,則需要進(jìn)一步利用超表達(dá)和干擾手段進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究成功克隆獲得山羊APOE基因序列(登錄號：MN049956,MN049957),其中ORF為951 bp,編碼316個氨基酸。 組織表達(dá)分析結(jié)果顯示該基因在山羊皮下脂肪中存在高表達(dá)；時序表達(dá)分析結(jié)果顯示,APOE基因在皮下脂肪細(xì)胞中誘導(dǎo)分化60 h時表達(dá)量最高,顯著高于未分化中的表達(dá)水平。通過組織表達(dá)譜和時序表達(dá)譜可以推測APOE在山羊皮下脂肪中發(fā)揮主要作用,該結(jié)果為闡明APOE基因如何調(diào)控脂肪細(xì)胞分化、脂肪沉積及脂質(zhì)代謝中的作用提供了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。