山羊KLF5基因生物學特征與時空表達分析

謝光杰，杜 宇,2，許 晴,2，馬潔瓊,2 ，邱 翔,2，林亞秋,2

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院,四川 成都 610041; 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川 成都 610041)

據(jù)報道2017年我國羊肉的產(chǎn)量已達到471.1萬t,同2007年的羊肉產(chǎn)量相比已上漲22.1%[1-2]。隨著羊肉在我國受歡迎程度不斷提高,提高羊肉肉質(zhì)的口感、鮮度等影響其食用的特征就迫在眉睫。目前,已知肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat, IMF)沉積對肉質(zhì)有重要的影響,而IMF沉積又受多種脂肪分化相關基因和信號通路等調(diào)控[3]。青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室山羊脂代謝課題組在前期研究中通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),Krüppel樣因子(Krüppel-like factors, KLFs)家族成員可能在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化前后存在差異表達,推測其可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

KLFs是一個能募集多種調(diào)控蛋白來發(fā)揮其作用的功能蛋白質(zhì)家族,目前已發(fā)現(xiàn)18個KLFs家族成員[4-6]。在結(jié)構(gòu)組成方面,KLFs家族成員既有高度的保守性,又有高度的可變性。所有的KLFs家族成員在其羧基末端均有3個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域,但研究發(fā)現(xiàn)不同的KLFs家族成員的功能結(jié)合域則有所差異[5]。KLF1、KLF2、KLF5和KLF7等有與乙酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的功能結(jié)合域；KLF3和KLF12等可能有與CtBP結(jié)合的功能結(jié)合域；KLF9、KLF10、KLF13 和KLF16等可能有與Sin3A結(jié)合的功能結(jié)合域[5]。因結(jié)構(gòu)的特異性,KLFs家族蛋白在細胞分化、增殖、凋亡和發(fā)育等生命活動過程中也發(fā)揮特異的生物學效應[5]。KLF1能夠刺激紅細胞的生成,KLF2、KLF4、KLF5、KLF7和KLF15等則參與脂肪細胞的分化[5，7]。在細胞凋亡方面,KLF4和KLF6被普遍認為是腫瘤抑制因子[8-9],KLF5則是凋亡抑制因子等[5]。

Krüppel樣因子5(Krüppel-like factors 5, KLF5)作為KLFs家族中的一員,目前已發(fā)現(xiàn)了多種生物學功能。在細胞增殖方面,KLF5既可通過加速細胞周期中的G1/S和G2/M期,又可通過參與RAS/MAPK、PI3K和Kinase C蛋白等多種生長因子信號通道來促進細胞增殖[5,10]。此外,KLF5還可通過誘導膽管上皮細胞增殖在膽管反應和膽管上皮組織擴展和重建中發(fā)揮關鍵作用,以致使肝臟再生[11]。在治療疾病方面,KLF5可作為多種疾病的潛在靶向治療基因。KLF5的沉默表達可通過阻斷NF-kB通路抑制人喉表皮樣癌細胞的增殖和遷移等來治療咽喉癌[12]。而KLF5的過表達則可通過PAN抑制足細胞中的ERK/p38 MAP kinase通路來治療糖尿病、腎病[13]。基于本課題組前期研究,更關注其在脂肪細胞分化中的作用,且有研究者證實KLF5在3T3-L1分化早期可經(jīng)C/EBPs β和δ誘導后促進PPARγ2的表達進而促進脂肪細胞分化[14-15]。另一方面,PPARδ激動劑又促進了KLF5的去SUMO化,去SUMO化的KLF5緊接著與轉(zhuǎn)錄激活復合體相聯(lián)系,隨后激活復合體激發(fā)了脂質(zhì)氧化基因的表達來促進脂肪細胞分化[16]。但目前為止關于KLF5在山羊脂肪細胞分化中的作用尚未見報道,因此,克隆獲得山羊KLF5基因的序列,并明確其組織和細胞表達模式是為了最終闡明其在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化中的調(diào)控作用所必需的基礎。

因此,本研究根據(jù)GenBank上山羊KLF5基因的預測序列設計引物,通過降落PCR克隆包含完整ORF的山羊KLF5基因序列,通過生物信息學分析獲得山羊KLF5基因的生物學特性,通過qPCR等方法構(gòu)建山羊KLF5基因的組織和細胞時序表達譜。本研究結(jié)果將為進一步通過超表達和干擾手段研究功能基因KLF5在山羊肌內(nèi)脂肪沉積中的具體作用提供重要的基礎數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料及取材 4頭24月齡的簡州大耳羊試驗動物由四川省簡陽大哥大牧業(yè)有限公司提供。經(jīng)合理屠宰后,采取簡州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、皮下脂肪和腹間脂肪等組織用DEPC水清洗后放置于液氮罐中帶回實驗室使用。山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞由本實驗室保存在液氮罐中。

1.1.2 主要試劑 購買于TaKaRa公司的TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ和TRIzol試劑,購買于ThermoFisher Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,購買于天根生化科技有限公司的2×GC-rich PCR Master Mix和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,購買于擎科生物技術有限公司的pClone007 Versatile Simple Vector Kit和TreliefTM5α Chemically Competent Cell,購買于美國Sigma公司的DEPC、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和油酸等。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊KLF5基因克隆 以GenBank中山羊KLF5基因預測序列(XM_018056510.1)為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設計克隆引物(表1)。以山羊肌內(nèi)脂肪細胞反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,通過降落PCR擴增山羊KLF5基因序列。擴增體系:ddH2O 9.5 μL,cDNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,2×GC-rich酶12.5 μL。PCR程序:94 ℃預變性30 s；94 ℃變性30 s,70 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,10個循環(huán),每1次循環(huán)退火溫度降低1 ℃；94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用凝膠電泳法驗證其大小后切割符合預期大小的凝膠提純,再取5 μL純化PCR產(chǎn)物驗證提純效率。將純化的目的片段與pClone007 VS載體連接,再轉(zhuǎn)化到超級感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)。將菌落PCR陽性結(jié)果對應的菌液送往生物技術公司進行測序。測序結(jié)果序列用Blast進行對比,檢驗其是否為目的基因序列。

表1引物信息Tab.1 The information of primers

1.2.2 山羊KLF5氨基酸序列分析 用ProtParam分析山羊KLF5蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；用NetPhos 3.1 Server和NetNGlyc 1.0 Server等預測山羊KLF5蛋白質(zhì)的修飾位點；利用SignalP 4.1在線工具預測山羊KLF5蛋白質(zhì)有無信號肽；用TMHMM對山羊KLF5蛋白質(zhì)的跨膜域結(jié)構(gòu)進行分析；用PSORT Ⅱ?qū)ι窖騅LF5蛋白質(zhì)進行亞細胞定位；利用GOR IV在線工具預測山羊KLF5蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用SMATR分析山羊KLF5蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域；利用SWISS-MODEL在線工具和VMD 1.9.3構(gòu)建山羊KLF5蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫分析山羊KLF5蛋白質(zhì)的互作蛋白；將測序得到的山羊KLF5蛋白質(zhì)的氨基酸序列在NCBI上同其他物種進行同源性分析；利用MEGA軟件以鄰接(Neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建KLF5的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 構(gòu)建山羊KLF5基因的組織表達譜 以克隆所得的山羊KLF5基因序列(登錄號:MN170986)為模板,利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性定量引物(表1)。提取山羊心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、皮下脂肪和腹間脂肪等組織總RNA,并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為qPCR模板。利用梯度PCR確定山羊KLF5基因的qPCR引物最適退火溫度(表1),使用qPCR技術分別檢測山羊KLF5基因和UXT內(nèi)參基因在上述簡州大耳羊組織中的表達量[17]。qPCR體系:ddH2O 7 μL,TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ 10 μL,上、下游引物各1 μL,組織cDNA 1 μL。qPCR反應程序:預變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 10 s,退火(KLF5基因:62 ℃;UXT內(nèi)參基因:60 ℃)10 s,延伸72 ℃ 15 s,38個循環(huán)。

1.2.4 山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞的復蘇及誘導分化 將本實驗室保存的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞進行復蘇,并將其培養(yǎng)傳代到F3。當F3細胞融合程度達到80%時,用50 μmol/L的油酸完全培養(yǎng)基進行誘導分化。收取誘導0,1,3,5,6 d的山羊肌內(nèi)脂肪細胞,提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA用以后續(xù)試驗。

1.2.5 構(gòu)建山羊KLF5基因的時序表達譜 以0,1,3,5,6 d的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,通過qPCR技術用特異性定量引物(表1)來檢測山羊KLF5基因在不同誘導分化階段的肌內(nèi)脂肪細胞中的表達量。qPCR體系及反應程序如1.2.3所述。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

用山羊UXT內(nèi)參基因的CT值均一化KLF5基因的CT值,并用2-ΔΔCt法對其CT值進行分析。不同山羊組織中KLF5基因的表達顯著性通過SPSS 17軟件中One-way ANOVA分析的Games-Howell 法檢驗。KLF5基因在不同誘導分化階段山羊肌內(nèi)脂肪細胞中的表達顯著性通過SPSS 17軟件中LSD法檢驗。上述檢驗結(jié)果均用GraphPad Prism 8.0繪制其表達譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KLF5基因克隆

以山羊肌內(nèi)脂肪細胞cDNA為模板,通過降落PCR擴增獲得山羊KLF5基因序列,獲得符合預期大小的凝膠電泳圖(圖1)。經(jīng)測序后Blast比對確定該基因為山羊KLF5基因。經(jīng)分析可知,克隆所得山羊KLF5基因序列為1 735 bp,其中完整的ORF序列1 365 bp(圖2),5′UTR序列8 bp和3′UTR序列362 bp。將測序序列上傳到GenBank,獲得登錄號MN170986。

M.DL2000 Marker; G.KLF5基因。M. DL2000 Marker; G.KLF5 gene.

2.2 山羊KLF5氨基酸序列分析

2.2.1 山羊KLF5理化性質(zhì)分析 山羊KLF5蛋白由454個氨基酸組成，可知其帶正電荷的賴氨酸和精氨酸殘基較多,有42個,而帶負電荷的谷氨酸和天冬氨酸殘基只有36個。由于帶正電荷的氨基酸多于帶負電的氨基酸,因此,山羊KLF5蛋白帶正電。此外,山羊KLF5蛋白質(zhì)分子式為C2236H3476N634O658S22,分子量大小是50.473 ku,理論等電點為8.76,不穩(wěn)定指數(shù)為71.12,平均親水系數(shù)為-0.611,所以山羊KLF5是不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)。

六邊形.絲氨酸磷酸化位點；星形.蘇氨酸磷酸化位點；圓形.酪氨酸磷酸化位點；實線框.低復雜結(jié)構(gòu)域；陰影框.C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。Hexagons.Serine phosphorylation sites;Stars.Threonine phosphorylation sites ;Circles.Tyrosine phosphorylation sites; The solid line boxes.Low complexity domains;Shadow boxes.C2H2 zinc finger domains.

2.2.2 山羊KLF5蛋白的修飾位點 山羊KLF5蛋白經(jīng)分析可知其含有豐富的磷酸化位點(圖2),并且還有34個O-糖基化位點和2個可能存在的N-糖基化位點。

2.2.3 山羊KLF5蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位分析 經(jīng)分析可知,山羊KLF5蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,預測結(jié)果說明,山羊KLF5蛋白主要在細胞核(78.3%)內(nèi)發(fā)揮功能(圖3-A)。

2.2.4 山羊KLF5蛋白的結(jié)構(gòu)特征與互作蛋白預測 分析山羊KLF5蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成可知較多的氨基酸組成無規(guī)卷曲,其余氨基酸分別組成α螺旋和延伸鏈(圖3-B)。在結(jié)構(gòu)域方面,山羊KLF5蛋白在其氨基酸第370-394位,第400-424位,第430-452位上分別具有1個高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(圖2)。此外,山羊KLF5蛋白質(zhì)還有4個可能存在的低復雜度結(jié)構(gòu)域(圖2)。山羊KLF5蛋白的羧基端三級結(jié)構(gòu)由3個α螺旋等組成(圖3-C)。在蛋白互作方面,可知CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ)可能對山羊KLF5蛋白起正調(diào)節(jié)作用(圖3-D)。

A.山羊KLF5蛋白的亞細胞定位預測:細胞核78.3%；線粒體17.4%；細胞骨架4.3%；B.山羊KLF5蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測:垂直線由長到短分別為α螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲；C.山羊KLF5蛋白羧基端三級結(jié)構(gòu)預測:由第362-454 位氨基酸預測所得；D. 山羊KLF5蛋白相互作用分析:綠色箭頭.正向活化反應；藍色圓形.未知結(jié)合；紅色矩形.負向抑制作用。

A. The predicted subcellular localization of KLF5 protein in goat: Nuclear 78.3%; Mitochondrial 17.4%; Cytoskeletal 4.3%; B.The predicted secondary structure of goat KLF5 protein: The vertical lines from the longest to the shortest in order indicated that the α-helices, extended strands and random coils, respectively; C. The predicted tertiary structure of goat KLF5 protein: Base on 362th-454th amino acid; D. Interaction analysis in KLF5 protein of goat: Green arrows.Positive activation; Blue rotundities.Unspecified binding; Red rectangles. Negative inhibition.

圖3 山羊KLF5蛋白的亞細胞定位、結(jié)構(gòu)特征和互作蛋白預測
Fig.3 The predicted subcellular localization, structural features and interaction proteins in KLF5 protein of goat

2.3 山羊KLF5基因組織表達譜的構(gòu)建

組織表達譜檢測結(jié)果顯示,山羊KLF5基因在被檢測的組織中均有表達,但在肺中相對表達量最高,顯著高于檢測的除腹間脂肪外的其他組織(P<0.05)(圖4)。

2.4 山羊KLF5氨基酸的同源性及系統(tǒng)進化樹分析

經(jīng)Blast比對可知山羊KLF5氨基酸序列與綿羊的同源性最高(圖5-A)。以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果也證明山羊和綿羊的KLF5氨基酸序列的親緣關系最近(圖5-B)。

2.5 山羊KLF5基因時序表達譜的構(gòu)建

通過時序表達譜可知，山羊KLF5基因在肌內(nèi)脂肪細胞誘導分化第3天和第5天中的表達量均與第0天和第1天的表達量差異顯著(P<0.05),且其表達量在誘導分化第5天時達到峰值(圖6)。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.背最長肌；7.皮下脂肪；8.腹間脂肪。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；n=4。圖6同。

1.Heart;2.Liver;3.Spleen; 4.Lung; 5.Kidney; 6.Longissimus dorsi; 7.Subcutaneous fat ; 8.Abdominal fat. Different lowercase letters showed significant difference (P<0.05);No obvious difference is indicated by the same letters (P>0.05);n=4.The same as Fig.6.

圖4 山羊KLF5基因的組織表達譜
Fig.4 Tissue expression profile ofKLF5in goat

A.KLF5氨基酸同源性對比；B.NJ法構(gòu)建KLF5氨基酸系統(tǒng)進化樹。A.Comparison of amino acid homology of goat KLF5; B.Phylogenetic tree constructed based on KLF5 amino acid with Neighbor-joining method.

圖6 山羊KLF5基因的時序表達譜Fig.6 Time-series expression profile of KLF5 in goat

3 討論與結(jié)論

作為一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,KLF5已被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等多種生命活動過程。Oishi等[14]在2005年發(fā)現(xiàn)的KLF5能促進3T3-L1分化形成成熟脂肪細胞引起了畜牧工作者的關注,因為成熟脂肪細胞的快速形成有利于動物脂肪沉積,因此,在家畜動物上對其進行研究具有重要的理論與實際意義,但在山羊中尚未見相關報道。本研究首先通過降落PCR克隆獲得山羊KLF5基因的完整ORF及部分UTR序列,并通過各種在線工具對山羊KLF5基因序列的理化性質(zhì)等進行了分析。通過分析修飾位點可知山羊KLF5蛋白具有的豐富磷酸化位點有助于其活性的表達[18]。此外,山羊KLF5蛋白的34個O-糖基化位點也為其在細胞核及細胞骨架中發(fā)揮生物學作用奠定了基礎[19]。由于山羊KLF5蛋白缺乏信號肽結(jié)構(gòu),因此,其預測得到的2個N-糖基化位點也很有可能不存在[20]。結(jié)構(gòu)域方面,山羊KLF5蛋白可憑借其3個鋅指結(jié)構(gòu)域來識別不同長度的核酸序列進而調(diào)控不同基因的表達[21]。蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)山羊KLF5蛋白可能與C/EBPα和C/EBPβ具有相互作用,Oishi等[14]和Zhu等[15]研究發(fā)現(xiàn)KLF5基因經(jīng)C/EBPβ和C/EBPδ誘導后可促進PPARγ2的表達從而促進3T3-L1的分化,為本研究的蛋白質(zhì)預測提供支持證據(jù)。另一方面,不同物種KLF5氨基酸的高度保守性也為不同物種KLF5蛋白發(fā)揮相似的生物學功能奠定了基礎。

為進一步明確山羊KLF5基因的組織表達特性,本研究構(gòu)建了山羊KLF5基因的組織表達譜。結(jié)果顯示,山羊KLF5基因在被檢測的各組織中均存在表達,但在肺組織中的表達量相對較高。Wan等[22]也發(fā)現(xiàn)KLF5在小鼠肺成熟階段必不可少,缺乏KLF5基因的轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后立即死于呼吸窘迫。這說明KLF5基因在肺的形成和成熟階段發(fā)揮巨大的生物學功能。但是Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)KLF5基因在4日齡雞的胸肌和腿肌中表達量相對較高,在肺中的表達量相對較少,這與本研究的結(jié)果存在差異,推測該基因在不同物種中具有組織表達特異性。本研究同時發(fā)現(xiàn)KLF5基因在腹間脂肪組織中亦存在相對較高的表達,結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果推測其可能參與山羊脂肪沉積。

明確KLF5在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化過程中的表達模式是闡明其調(diào)控作用的重要基礎。因此,本研究利用qPCR方法檢測了KLF5基因在分化0～6 d山羊肌內(nèi)脂肪細胞中的表達模式,明確了KLF5基因在脂肪細胞分化前后的表達差異。即在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞誘導分化前后,KLF5基因的表達量增加,且在誘導分化第5天時達到最大值,推測該基因在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化中具有正調(diào)控作用。在Oishi等[14]的研究中,它們發(fā)現(xiàn)3T3-L1經(jīng)誘導分化1 h后KLF5基因的表達量增加并且在3 h內(nèi)達到最高值,此后表達量逐漸降低。這與本研究存在相似及不同之處,可能因為選取的檢測時間及誘導液成分不同有關。本研究僅僅明確了KLF5基因在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化前后的表達差異,為了最終闡明KLF5對山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化的調(diào)控作用及機制,本實驗室則擬用過表達載體構(gòu)建、超表達、RNA干擾及West Blotting等手段進行進一步研究。

本研究成功克隆了山羊KLF5基因序列(登錄號:MN170986),其ORF全長為1 365 bp,編碼454個氨基酸。山羊KLF5具有的各種蛋白質(zhì)修飾位點和結(jié)構(gòu)域等均有助于其活性的表達。組織表達譜表明KLF5基因在山羊肺中存在較高水平的表達。時序表達譜顯示，山羊KLF5基因在肌內(nèi)前體脂肪細胞經(jīng)誘導分化后表達量均升高,并且在誘導分化第5天時表達量最高。本研究將為進一步研究KLF5基因?qū)ι窖蚣?nèi)脂肪沉積的調(diào)控作用提供科學依據(jù)。