添加硒、鎢元素對豬糞厭氧發酵的促進機制

陳 彪，郭紹英，陳 芳，黃 婧，肖艷春,*

（1.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福州 350003；2.武夷學院福建省生態產業綠色技術重點實驗室，福建 武夷山354300；3.福建技術師范學院近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室，福建 福清 350300）

隨著我國養殖業集約化、規模化的快速發展，畜禽糞便產量逐年增加，已成為主要的農業污染源之一，直接影響農業生態環境和農業生產安全，正確處理和利用養殖廢棄物已成為養殖業健康良性發展的關鍵因素[1]。作為農業廢棄物資源化和能源化利用處理主要手段之一的厭氧發酵技術，具有處理廢物和回收清潔沼氣能源的雙重特點[2-4]。但是厭氧發酵效率及運行穩定性受到多個因素的影響，其中微量元素的缺乏能夠導致產甲烷菌生物活力下降，有機物降解不完全，進而影響整個厭氧反應器的運行效果和穩定性等[5-6]。

目前，已有大量文獻報道了微量元素對厭氧發酵的積極作用。Zandvoort等[7]指出，微量元素不僅參與合成厭氧微生物，而且還參與合成和激活厭氧發酵產甲烷過程中的多種酶系統，對厭氧發酵的產甲烷階段起著重要調控作用。張萬欽等[8]歸納了微量元素在以“乙酸、H2及CO2和甲基化合物”為原料的3種甲烷生物合成途徑中的作用，綜述了Fe、Co、Ni等單一微量元素及多元素組合對厭氧發酵產甲烷過程中的積極影響。Zhang等[9]研究了Zn對豬糞厭氧發酵過程中沼氣產量的影響，添加125 mg·L-1（低濃度）和1250 mg·L-1（高濃度）Zn的豬糞沼氣產量分別比不添加Zn的對照組增加51.2%和56.0%。丁福貴等[10]研究了微量元素（Fe、Co、Ni、Mo、Zn、Mn、W）及生長因子對寒區豬糞沼氣發酵的影響，篩選了以Fe、Co、Ni和酵母粉為化學促進劑的最佳優化組合。陳琳等[11]研究了豬糞中Cu含量對厭氧發酵過程中水解酶活性及產氣進程的影響，結果表明，中、高濃度的重金屬Cu對水解酶活性有顯著的抑制效應。由此可見，不同學者圍繞Fe、Co、Ni等關鍵微量元素在以乙酸為原料的甲烷生物合成主要途徑中的作用機制進行了較為深入的研究，但是在構成整個厭氧發酵系統不可或缺的以H2及CO2為底物的甲烷生物合成路徑中，微量元素Se、W對豬糞厭氧發酵過程中有機酸的互營氧化效應以及產甲烷作用機制的影響尚未引起普遍關注，國內外文獻也鮮有報道。

本試驗在前期研究[12-14]的基礎上，采用批式厭氧發酵方式，以豬糞為發酵底物，在溫度、pH等因素和運行正常的條件下，開展微量元素Se、W對厭氧發酵的影響研究，尤其從厭氧產酸階段的總揮發性脂肪酸（TVFAs）和產甲烷階段的甲烷產率變化視角，應用一級動力學和Gompertz模型擬合探析Se、W對厭氧發酵過程甲烷產率的影響效應，以提高畜禽糞污等有機廢棄物厭氧發酵的生物產甲烷效率（BDA），有效提升厭氧發酵技術應用水平，為厭氧發酵過程中微量元素Se、W的功能效應提供基礎的技術支持和科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬糞和接種污泥分別取自福建莆田、南平、平潭、漳州等養殖區養豬場。鮮豬糞取回后置于4℃冰箱中保存。接種污泥取回后置于（35±1）℃恒溫箱中保存。鮮豬糞和接種污泥的特性分析在樣品取回3 d之內完成，檢測的基本理化性質見表1，微量元素及需求量見表2。

1.2 試驗裝置

采用升流式厭氧污泥床（UASB）發酵裝置進行批式試驗。該裝置材質為有機玻璃，有效容積5 L，內置水浴加熱、溫度和壓力傳感器，具有數據監測自動校正功能，示意圖見圖1。料液由進料口加進后密封，通N210 min保持厭氧發酵環境，生物氣從頂部的出氣孔導出記錄體積、收集并監測氣體成分。

1.3 試驗設計

由表2可知，與需求量相比，試驗豬糞和接種污泥中含有較高本底值的關鍵微量元素Fe、Co、Ni、Mo、Cu、Zn，滿足厭氧發酵需求[15-17]，而影響產甲烷途徑關鍵酶生物活性的微量元素Se、W缺乏。本試驗在綜合前人[8，15-18]試驗研究的基礎上，借鑒 Feng等[18]通過添加微量元素Se、W對食品工業廢棄物厭氧發酵影響的研究結果，探析微量元素Se、W在該濃度范圍內對豬糞厭氧發酵的影響，試驗設計見表3。以鮮豬糞為原料，每組總進料量5 kg，其中豬糞1 225 g，接種物1 000 g（接種量20%），加去離子水調節TS約8%，將物料混勻后備用。將不同濃度梯度的Se、W組合與備用料液攪拌均勻通過蠕動泵導入UASB發酵裝置?？瞻捉M為只添加接種物和去離子水；CK組為對照組，不添加微量元素Se、W；L組為添加低濃度Se、W（0.4 mg·L-1和0.9 mg·L-1）；M組為添加中濃度Se、W（0.8 mg·L-1和1.8 mg·L-1）；H組為添加高濃度Se、W（1.2 mg·L-1和2.7 mg·L-1）。進料結束后向厭氧裝置中通入N2，調節溫度（35±1）℃，每個處理組重復3次，每日定時測定產氣量、氣體成分和發酵液中的VFA濃度。

表1 豬糞及接種物的基本理化性質Table 1 Basic properties of the pigmanure and the inoculated sludge

表2 豬糞及接種物中主要微量元素含量及相應的厭氧發酵需求量（mg·L）Table 2 Contents of main trace elements in pig manure and inoculated sludge and their demand for anaerobic fermentation（mg·L-1）

1.4 試驗方法

TS、VS分別采用烘干法和灼燒減重法測定[19]，測定溫度分別為105℃和600℃；C、H、O、N、S元素的質量分數采用元素分析儀測定[20]；樣品經HNO3-HClO4消煮后，采用等離子體發射光譜儀（ICP–AES）分析測定Fe、Cu、Zn、Ni、Mo、Se、W、Co微量元素[21]含量；采用氣相色譜儀檢測VFA質量濃度，用5%的硫酸溶液調節 pH 值＜3.0，10 000 r·min-1離心 10 min，上清液經0.45μm硝酸纖維素膜過濾后用丙酮稀釋5倍，進樣口、檢測器溫度均為200℃，載氣流量8.00 mL·min-1，M12毛細管柱（30 m×0.53 mm×1 μm，Thermo）[22]；沼氣日產氣量使用濕式流量計測定；沼氣中甲烷含量采用氣相色譜儀測定，色譜柱為Φ10 m×2 mm不銹鋼色譜柱，甲烷檢測條件：氫氣分壓為0.6 MPa，流速為20 mL·min-1，進樣口溫度、柱溫及檢測器（TCD）溫度分別為120、50℃和120℃，進樣為0.5 mL[19]。

圖1 UASB發酵裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of the UASBfermentation reactor

1.5 數據分析

1.5.1 發酵原料理論產甲烷潛力值

發酵原料的理論產甲烷潛力值是指在適宜的厭氧發酵條件下，單位質量的某原料在一個發酵周期內所能產生的甲烷總量，可作為發酵工藝設計評估的重要科學依據[23]。目前，比較有效的發酵原料理論產甲烷潛力值的計算方法是在元素分析的基礎上，用Bus?well方程[24]計算理論氣體組成：

表3 試驗設計Table 3 Experimental design

進而通過方程式（2）便可估算出發酵原料的理論產甲烷潛力值Xe（mL·g-1TS）：

1.5.2 發酵底物產甲烷動力學

應用一級動力學模型（公式3）和Gompertz模型（公式4）擬合厭氧發酵過程并計算動力學反應常數[25]，根據決定系數R2對模型的擬合度進行比較，文中涉及的甲烷產率均是相對于豬糞中VS含量。

一級動力學方程如下：

式中：X∞為整個發酵周期內豬糞甲烷產率，mL·g-1；Xt為t時刻豬糞甲烷產率，mL·g-1；k為反應速率常數，d-1；t為發酵時間，d。

式中：Rm為產甲烷速率，mL·g-1·d-1；e為常數，2.718 282；λ為遲滯時間，d。

1.5.3 發酵底物生物轉化產甲烷效率

以不同時間段甲烷累積產量與整個發酵周期甲烷總產量的比值表示發酵過程甲烷產率比（Methane production ratio，MPR）[27]。

底物厭氧發酵的生物轉化產甲烷效率[28]（Biode?gradability，BDA）通過下式計算：

式中：Xt為t時刻VS的甲烷產率，mL·g-1；Xe為VS的理論甲烷產率，mL·g-1。

1.5.4 數據處理

采用SPSS 25.0進行數據處理及方差分析（顯著性水平設置為0.05），采用Origin 8.0軟件進行繪圖及方程擬合。對照組和試驗組的沼氣產氣量、甲烷體積分數及VFA的試驗數據均扣除了空白組的影響且為3次重復的平均值。

2 結果與討論

2.1 添加微量元素Se、W對沼氣產氣量的影響

圖2為厭氧發酵過程中沼氣日產氣量曲線圖。各組的產氣啟動期均較短，沒有明顯的遲滯期，這是由于試驗接種污泥取自運行良好的沼氣工程厭氧發酵反應器，且經過進一步馴化并富含生物活性顯著的功能微生物。在厭氧發酵進程中，沼氣日產氣量總體呈現先上升后下降的趨勢，各組均出現3個產氣高峰，與已有研究報道保持一致[29]。其中，CK組的產氣高峰分別出現在第4、10 d和21 d，添加微量元素Se、W的3個處理組（L、M和H）的產氣高峰均分別出現在第3、7 d和12～15 d，與CK組相比，對應的產氣高峰均提前；產氣速率在厭氧發酵前期迅速增大，表4顯示各組間最高日產氣量差異顯著（P＜0.05），最佳M組在第7 d產生的最高日產氣量（12 712 mL）比CK組在第10 d產生的最高日產氣量（11 253 mL）增加13.0%。圖3反映了累積沼氣產氣量變化規律，各組間差異顯著（P＜0.05）。M組的累積沼氣產氣量最大（177 001 mL），與最小的 CK 組（160 595 mL）相比提高了10.2%；L、H組的累積沼氣產氣量分別比CK組提高了4.9%和8.8%。試驗結果表明：添加Se、W微量元素對厭氧發酵產沼過程均有不同程度的積極作用，表現為產氣速率加快、產氣量提高和產氣峰值提前。已有研究[8，18]報道顯示Se、W是構成甲基呋喃脫氫酶和甲酸鹽脫氫酶活性中心的關鍵元素，其生物有效性與脫氫酶的活性、產沼效應呈正相關。本試驗進一步驗證了適量Se、W的加入能夠促進厭氧發酵產沼進程，提高沼氣產氣量。

圖2 沼氣日產氣量隨發酵時間變化曲線Figure 2 Variation curve of daily biogas production

圖3 累積沼氣產氣量Figure 3 Cumulative gas production

表4 沼氣產氣量差異顯著性分析Table 4 Significant analysis of differences of daily and cumulative biogas production

2.2 產甲烷動力學分析

2.2.1 添加微量元素Se、W對VFA的影響

揮發性脂肪酸（VFA）是衡量厭氧發酵過程微生物代謝狀態的一個重要指標[22]。從圖4a、圖4b可以看出，乙酸占TVFAs的60%左右，各組變化規律基本一致，均是先上升后下降，最后趨于平穩。在發酵初始階段水解速率大于產甲烷速率，TVFAs濃度迅速升高，CK組在第3 d達到產酸高峰，L、M和H組比CK組提前1 d達到產酸高峰，這可能是因為微量元素Se、W在水解酸化階段生成的金屬螯合物提高了產酸菌的活性，縮短了產酸相的反應時間，導致產酸峰值提前；隨后，TVFAs和乙酸濃度迅速下降，至發酵結束，L、M和H組的TVFAs和乙酸累積量明顯低于CK組，表5顯示各組間的TVFAs和乙酸累積量均差異顯著（P＜0.05），其中，M組積累最少，比CK組分別降低57.6%和41.4%。這表明適量添加微量元素Se、W可能改變了發酵產酸菌的群落結構[30]，直接影響發酵系統中VFA的濃度；產酸菌與產甲烷菌的互營共生關系，間接影響產甲烷菌菌群的多樣性及菌群豐度[31]，促進產甲烷活動的發生。因此，添加適量Se、W能起到緩解TVFAs積累的作用，促進產甲烷進程。

圖4 TVFAs、乙酸和丙酸質量濃度變化Figure 4 Variations of concentrations of TVFAs,acetic acid and propionic acid

丙酸是最易積累且最難被降解的一種脂肪酸[22]。由圖4c可知，CK組的丙酸濃度并未隨TVFAs濃度的降低而降低，而是在高濃度2 356～2 484 mg·L-1區間內維持14 d（第3～16 d）后逐漸下降，L、M和H組在第2 d到達峰值后迅速下降，發酵結束時丙酸累積量明顯低于CK組，表5顯示各組間丙酸差異顯著（P＜0.05），其中，M組積累最少，比CK組降低91.9%。Se、W是合成甲酸鹽脫氫酶（Se參與）、甲基呋喃脫氫酶（W參與）和氫化酶（Se參與）必需的輔因子，催化丙酸轉化生成CO2的系列化學反應，進而促進以CO2和H2為底物合成甲烷的產甲烷菌活性，促進程度為M＞H＞L＞CK。其他相關學者的研究[14，32-33]也證實了 Se、W能夠通過調節電子轉移，促進丙酸降解，緩解丙酸積累。本試驗也得到類似結果。

2.2.2 添加微量元素Se、W對甲烷產率的影響

圖5 沼氣中甲烷體積分數變化曲線Figure 5 Variation curve of methane volume fraction in biogas

甲烷產率是單位質量的有機物經厭氧發酵產生甲烷的體積，主要用于表征有機物轉化產甲烷的能力[34]，反映厭氧發酵過程TVFAs轉化為甲烷的效率。由圖5可知，甲烷體積分數均呈現先快速增長后趨于穩定的變化趨勢。CK組的穩定期為14 d（第6～19 d），從第20 d開始呈波動式下降；L組的穩定期為26 d（第4～29 d），從第30 d開始呈震蕩式下降；M組和H組的穩定期為32 d（第4～35 d）。L、M組和H組穩定期明顯優于CK組。由表6可知，各組間平均甲烷體積分數及甲烷產率均差異顯著（P＜0.05），L（66.2%）、M（68.3%）和H（67.2%）組的平均甲烷體積分數分別比CK組（62.2%）提高6.4%、9.8%和8%；M組的累積甲烷產率最高（398.3 mL·g-1），與CK組（328.1 mL·g-1）比提高21.4%。Gerhard等[35]向培養基中加入能刺激產甲烷菌生長的微量元素Se、W，CO2轉化為甲烷和生物量的效率提高了25%。研究結果表明，適量添加Se、W能夠促進產甲烷菌的生長和激活酶的活性，豐富產甲烷菌的多樣性，提高合成甲烷的前體物質（包括乙酸及CO2、H2等）的利用率，對提高甲烷產率和保障厭氧發酵系統運行穩定性均有顯著的促進作用。

2.2.3 甲烷產率動力學模型

試驗采用一級動力學模型和Gompertz模型擬合各組厭氧發酵產甲烷過程，表7列出了2種模型的擬合參數。

從擬合結果可以看出，Gompertz模型的決定系數R2均大于0.998，擬合精確度高，而且甲烷產率的擬合值與實測值接近，最大差值僅為1.0%，說明該模型可以較為準確地反映各組產甲烷過程。一級動力學模型的決定系數R2均小于0.978，且擬合值與實測值偏差較大，說明不適合用此模型擬合厭氧發酵過程。Gompertz模型中，CK組的產甲烷速率最小（19.1 mL·g-1·d-1），M組的產甲烷速率最大（31.0 mL·g-1·d-1），與CK組比提高62.3%，H、L組次之（28.6、24.5 mL·g-1·d-1），與CK組比分別提高49.7%和28.3%。另外，M組的遲滯期最短（1.13 d），與CK組（1.93 d）比縮短41.5%。由此可見，向缺乏某一種或幾種微量元素厭氧發酵系統中補充相應的微量元素利于產甲烷菌的生長繁殖，產酸階段產生的乙酸、丙酸等揮發性脂肪酸作為營養物質和能源及時地被產甲烷菌代謝生成甲烷，同時也促進了水解反應的正向進行。因此，添加適量的微量元素Se、W能夠促進產酸菌和產甲烷菌快速建立平衡狀態，提高揮發性脂肪酸互營氧化效率，促進產甲烷進程，表現為產甲烷速率提高和遲滯期縮短。

表5 發酵過程中累積產生的總揮發性脂肪酸、乙酸和丙酸的差異顯著性分析Table 5 Significant analysis of differences of TVFAs，acetic acids and propionic acids duringfermentation

表6 平均甲烷體積分數與甲烷產率差異顯著性分析Table 6 Significant analysis of differences of average percentage and yield of CH 4

2.3 微量元素Se、W對厭氧發酵生物產甲烷效率的影響

根據發酵原料（表1）元素分析結果可知豬糞的化學組成為C105H110O58N8S1，通過方程（2）和VS/TS計算豬糞的理論產甲烷潛力為566.7 mL·g-1，高于M?ller等[36]通過豬糞中碳水化合物、蛋白質和脂肪等通用分子式計算獲得的理論產甲烷潛力516 mL·g-1。表8為各組在不同發酵時間的BDA和MPR值。BDA為衡量原料甲烷轉化是否徹底的重要參數。由表可知，發酵進行到第17 d時，L、M組和H組的BDA比CK分別提高16.7%、37.6%和31.1%，其中M組在第13 d的BDA值（56.6%）與CK組第26 d的BDA（56.5%）接近；發酵結束時L、M組和H組的BDA分別達到64.9%、70.3%和68.2%，明顯高于CK組的BDA（57.9%）。MPR可作為確定水力停留時間（HRT）的重要依據，本研究中以MPR等于90%表示厭氧發酵反應過程結束[37]。各試驗組的厭氧發酵結束時間分別為18.92、16.23 d和17.01 d，其中M處理的HRT最短，比CK組（20.23 d）縮短了4 d。試驗結果表明，添加微量元素Se、W可提升發酵底物的轉化效率并大大縮短發酵水力停留時間，在實際應用中，BDA的提高和HRT的縮短意味著更高的發酵反應器有效容積利用率，利于成本降低。

3 結論

（1）添加外源微量元素Se、W在調控揮發性脂肪酸積累和提高產氣量、甲烷體積分數、產甲烷速率及甲烷產率等方面均有不同程度的積極作用，其中中濃度M組（Se 0.8 mg·L-1、W 1.8 mg·L-1）對厭氧發酵效率的促進效應最為顯著，累積產氣量（177 001 mL）、平均甲烷體積分數（68.3%）和BDA（70.3%）比CK組分別提高了10.2%、6.1%和21.4%，厭氧發酵過程的促進效應及其變化規律符合Gompertz模型。

表7 擬合方程對各處理組甲烷產率曲線的擬合結果Table 7 Model-fitting for methane production curves

表8 厭氧發酵過程部分時間點的MPR和BDATable 8 Methane production ratio and biodegradability at some points of the anaerobic fermentation process

（2）甲烷產率與TVFAs質量濃度呈負相關，隨微量元素添加量的增加先增加后降低。微量元素Se、W能夠促進產甲烷菌和酶的活性，加快揮發性脂肪酸轉化為甲烷的反應速率，促進產甲烷進程，其中對丙酸降解效應尤為顯著。M組效果最佳，呈現出最低TVFAs累積量（809 mg·L-1）、最大產甲烷速率（31.0 mL·g-1·d-1）和最短水力停留時間（16.23 d）和遲滯期（1.13 d），表明添加微量元素Se、W可提高豬糞厭氧發酵效率（T90）、縮短厭氧發酵遲滯期。對于易發生酸敗現象的厭氧發酵系統，建議添加適量微量元素Se、W，通過調節系統內產酸菌和產甲烷菌互營氧化效率恢復運行。研究結果可為厭氧發酵技術實踐應用提供技術參考和借鑒。