重視呼吸道病毒感染的實驗室檢測

劉洋

（南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006）

急性呼吸道感染可引起多種臨床疾病,每年造成約425 萬人死亡,已成為人類第三大常見疾病[1]。其中病毒引起呼吸道感染約占急性呼吸道感染的70~80%[2]。盡管細菌以前被認為是呼吸道感染的主要病原，但細菌感染常可通過培養、診斷標志物檢測等診斷，而病毒則很難在臨床條件培養，且存在標志物少、診斷窗口期短等缺點，導致病毒感染一直被臨床低估及忽視。近年來，隨著各種呼吸道病毒感染疾病在世界范圍內流行,呼吸道病毒感染被廣受重視[3]。呼吸道病毒主要包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、腺病毒和鼻病毒等[4]。其中流感和呼吸道合胞病毒每年可造成近30 萬五歲以下的兒童死亡,而腺病毒和鼻病毒等發病率高和死亡率高[5,6]。特別是，幾種具有潛在流行性特征的新發呼吸道病毒威脅全球,包括急性呼吸系統綜合征-冠狀病毒（SARS-CoV）、禽流感病毒 H5N1，H7 N9 和H10N8、甲型H3N2 流感病毒變種、豬源甲型HIN1 流感、人14 型腺病毒、新冠病毒(SARS-CoV-2)以及中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。目前對 SARS-CoV-2、MERS-CoV 和 H7N9 的發病機制和傳播方式仍知之甚少,因此盡早作出病原學診斷直接影響對其治療、干預和預防措施的實施。

近年來新檢測技術和方法不斷涌現并應用于臨床，如核酸分子擴增、基因芯片、基因測序及質譜技術等。這些方法具有高通量、高敏感性、可同時檢測多指標的特點,為病毒檢測帶來了技術上的革新，但也存在假陽性、假陰性率，以及受操作和臨床多種因素影響等等。因此，在建立區分呼吸道病毒感染和呼吸道細菌感染方法同時,應規范標本的采集、儲存、運輸、檢測過程，提高對呼吸道病毒感染標本檢測效率和準確率。

1 重視區分呼吸道病毒感染和呼吸道細菌感染[7]

以臨床癥狀、影像學及實驗室檢查診斷呼吸道病毒感染和呼吸道細菌感染是CAP （社區獲得性肺炎）診斷的重要方式。流行病學研究顯示，呼吸道細菌性感染在發生人群和體征上與呼吸道病毒感染存在差異。研究發現病毒性肺炎患者常有心臟病等并發癥，且年齡較大[8]。Liu 等[9]報道病毒性肺炎導致更多的咳嗽和較少的胸膜疼痛，而Jennings 等[10]人發現肌痛通常與病毒性疾病有關的癥狀。影像學上，呼吸道細菌感染常與局灶性肺泡浸潤相關,而呼吸道病毒感染常為雙側間質性肺部浸潤。降鈣素原等標志可作為病毒感染診斷的重要依據。降鈣素原產生依賴于循環重腫瘤壞死因子的存在，而在病毒感染中，巨噬細胞產生的干擾素可抑制腫瘤壞死因子, 進而抑制降鈣素原的升高。盡管呼吸道病毒感染與細菌感染存在一定差異,但目前仍難以準確區分。因此，準確有效的診斷方法對呼吸道病毒疾病的控制至關重要。

2 呼吸道病毒感染標本采集、運送、儲存及預處理

2.1 呼吸道病毒感染標本的采集 正確采集標本是保證診斷準確性的前提。標本來源主要為呼吸道、血液及泌尿消化道，采集方法包括無創和有創方法，前者主要集中在部分呼吸道、泌尿及消化道標本上,對患者創傷小，易于接受，但易受定植菌群干擾。后者通過有創性操作，從正常狀態下“相對無菌”的部位取材，對診斷的意義更大。針對不同種類呼吸道病毒感染標本采集如表1 所示。其中組織活檢標本是呼吸道病毒感染確診的金標準。

表1 呼吸道病毒感染標本種類及采集要求[11-16]

2.2 呼吸道病毒感染標本的運送與儲存 呼吸道病毒感染標本運送和儲存原則：⑴標本標簽和申請單信息完整。標簽應貼在容器上，而非容器蓋上[17,18]。⑵采集盡量保持無菌操作，避免被污染。⑶所有標本采集后應在2h 內送檢, 轉送時間超過規定時間時應冷藏運送。小樣本量標本應于采樣后30分鐘內送檢，避免標本干涸。⑷保證必要的運送條件，對標本運送條件有不同要求。見表2。

3 呼吸道病毒實驗室檢測

3.1 病毒培養和鑒定 病毒分離培養一直是病毒鑒定的 “金標準”。常用培養細胞有人肺癌細胞A549、貂肺上皮細胞(MvlLu)、馬丁達比犬腎細胞(Madin-Darbv canine kidnev, MDCK)。不同的病毒培養時間不同, 一般數日到2 周不等。以細胞病毒效應（CPE）作為確認病毒生長的觀測指標，大多數病毒CPE 出現時間為5～10d。此法可以分離檢測多種病毒，實現呼吸道病毒混合感染的診斷。此次新冠肺炎疫情中,我們也發現部分病例存在新冠病毒與流感病毒、呼吸道合胞病毒等混合感染[19]。病毒分離培養可用作抗病毒藥物、疫苗研究、血清分型及流行病學研究等。但傳統病毒細胞培養繁瑣、費時，診斷效率低，臨床應用受限。

表2 呼吸道病毒感染標本轉運通用原則[18]

近年來，基于病毒培養金標準的特性，開發了改良后的病毒培養方法,如病毒離心培養法,基于低速離心增加病毒對培養細胞的感染性,目前已經應用在呼吸道病毒的培養中。也存在基于免疫學改良的病毒培養技術，如pre-CPE 技術，通過酶標或熒光標記的單克隆抗體在CPE 出現之前完成檢測。也可采用混合細胞培養法，提升病毒檢出率的同時，實現多種病毒同時檢測。此外，還有轉基因細胞培養法，通過特定基因轉入細胞后，使得特定病毒轉入細胞時產生易于測定的酶,提高病毒檢出率及特異性。

3.2 呼吸道病毒直接抗原檢測 采用免疫學手段，如酶聯免疫檢測（ELISA）、免疫層析、免疫熒光技術等，可檢測流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多種病毒抗原[20,21]。常用標本類型為咽拭子、氣管鏡吸取物、BALF 和肺穿刺活檢標本等。應用方便快捷，但靈敏度較差[22]。以呼吸道合胞病毒為例，ELISA 及免疫熒光技術是傳統檢測呼吸道合胞病毒, 其中以呼吸道合胞病毒F 蛋白為靶標的改良ELISA 技術可在25min 內完成，成本低廉。此外，還可以使用直接免疫熒光技術檢測呼吸道合胞病毒，靈敏度和特異度分別高達94%和96.8%[23]。

3.3 呼吸道病毒抗體檢測 采用免疫學手段，如酶聯免疫檢測、免疫層析檢測、磁微粒化學發光技術等，可檢測流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒等多種病毒血清抗體。免疫學方法檢測呼吸道病毒抗體存在窗口期、假陽性等缺點，診斷滯后。如新冠病毒抗體檢測時很容易因患者標本中存在內源性或外源性干擾物質（類風濕因子、補體、嗜異性抗體等）導致免疫測定假陽性，而抗體檢測假陰性常又因發病早期抗體可能尚未出現,包被抗原質量對抗體檢測的敏感性等造成。因此，呼吸道病毒抗體檢測常常只作為呼吸道病毒感染診斷的補充手段。

3.4 呼吸道病毒核酸分子檢測 核酸分子檢測已成為呼吸道病毒感染診斷的重要手段。根據病毒基因序列可快速建立測定方法,快速應對傳染病疫情對病原學診斷的需求,顯著提高了呼吸道病毒感染檢測的敏感性, 可在數小時內快速獲得檢測結果，既解決了傳統病毒培養困難、培養周期較長等問題，也彌補傳統免疫學手段陽性率低的缺點。

3.4.1 聚合酶鏈式反應（PCR）技術 PCR 檢測具有高敏感性、高特異性、快速、經濟等特點,已經成為了呼吸道病毒感染最常選擇的檢測方法。隨著逆轉錄 PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）、多重 PCR （multiplex PCR，mPCR）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等技術的應用，可實現多種呼吸道病毒實時定量同步檢測[24-26]。新冠肺炎疫情發生初期,也是最先建立RT-PCR完成核酸檢測。其中建立多重PCR 方式以提高對多種呼吸道病毒核酸檢測的高效性,多重呼吸道病原體基因檢測(Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel，NxTAG-RPP)可在一個閉管中同時檢測22 呼吸道病原體。在多重PCR 基礎上，聯合毛細電泳片段分析方法可完成對呼吸道病毒核酸的檢測。目前成熟的多重PCR 檢測呼吸道病毒感染的方法還包括mOTNRT-PCR、Panther Fusion respiratory assay、FTD21 kit、GeXP assay、Qiagen ResPlex II V2.0 kit、FilmArray multiplex PCR system[27-29]。

3.4.2 等溫(恒溫)擴增技術 等溫擴增過程僅在恒定溫度下完成擴增，在加快擴增速度的同時,也降低了對儀器設備的依賴性。目前主要包括環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環核酸擴增（rolling circleamolification,RCA）、核酸序列擴增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、解鏈酶擴增（Helicase-dependent amplification，HDA）、鏈置換擴增（Strand displacement amplification，SDA）等[30]。其中 LAMP技術主要通過環介導等溫擴增的六個區域設計四條引物, 利用鏈置換型DNA 聚合酶在恒溫條件下進行擴增反應,可在15~60min 內實現109~1010 倍的擴增,可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在。目前此項技術已經在新冠病毒核酸檢測中廣泛開展。由于不需要實施溫度梯度，可以實現隨到隨測的急診模式，顯著縮短傳染病疫情門急診疑似病人的病原學診斷的等待時間。

3.4.3 芯片檢測 近年來芯片技術發展迅速，基因芯片、蛋白質組芯片等技術已經逐漸應用到臨床診斷的許多領域。病毒基因檢測芯片可根據病毒特征基因序列設計寡核苷酸探針,固定在基質上制成芯片, 從來源于患者的樣品中提取病原體核酸,經擴增和熒光標記后和芯片雜交檢測。將微流控芯片技術與核酸擴增技術結合,已經形成了商業化的病毒核酸檢測芯片產品,可短時間內完成多種病毒基因檢測，實現快速、廣譜、高效的診斷需求[31]。

3.4.4 病毒基因測序 基因測序可通過對核酸序列的解碼完成病毒的識別和鑒定[32]。目前一代測序技術已經廣泛在臨床開展及應用,通過Sanger 測序等方法獲得特定病毒的基因片段，進而獲取其序列信息，完成病毒鑒定，但也存在核酸信息數據量少、鑒定能力不足且成本高昂等缺點。

二代測序（next-generation sequencing，NGS）可同時檢測多種病毒的保守基因序列,提供呼吸道標本中所有病毒的基因組信息及病毒組成,完成對呼吸道病毒高通量檢測[33]。而宏基因組測序直接對呼吸道標本中的病毒核酸進行高通量測序,得到的序列信息與數據庫進行比對,可識別包括已知和未知呼吸道病毒,在罕見病毒及新發呼吸道傳染性病毒診斷方面具有顯著優勢[34]。但目前宏基因組測序花費昂貴,且存在宿主基因的干擾是限制其應用的主要問題。而此次新冠病毒早期發現也是得益于基因組測序技術的發展,提升了臨床對新發傳染性呼吸道病毒的早期預警能力。

3.4.5 其他快速檢測技術 隨著生物醫學技術的發展,色譜技術、光譜技術、生物傳感器及光電分析技術、計算機芯片技術在臨床上的應用日益增加，聯合免疫和分子生物學技術的引進,病毒檢測呈現床旁化、自動化及簡單化趨勢。質譜技術具備快速、靈敏、特異及高通量等特點，目前已經廣泛應用于細菌的鑒定之中, 而在病毒檢測領域應用相對較少。液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術可用于檢測臨床樣本和分離培養樣本中的病毒蛋白質組。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDITOF MS)技術也可用于檢測呼吸道病毒及型別。

表3 不同呼吸道病毒診斷技術的優缺點[35]

綜上所述，病毒培養、抗原抗體檢測等傳統的實驗室病毒檢測技術所存在的短板難以實現快速有效、敏感診斷呼吸道病毒感染的需求。分子診斷技術已逐步成為病毒實驗室診斷的核心,可縮短診斷的窗口期，提升了病毒感染診斷的能力。以核酸擴增技術及基因測序技術為主導的新型分子診斷技術的應用,徹底改變了呼吸道病毒感染診斷的進程,在經歷 2003 年 SARS、2009 年 H5N1，再到 2020年SARS-CoV-2 的洗禮,呼吸道病毒感染的分子診斷正逐步走向成熟。因此，在應對呼吸道病毒感染中，建立更快速、更靈敏的、更特異的病毒檢測診斷體系，尤其是針對新發傳染性呼吸道病原體，簡單、快速的高通量定性或定量病毒檢測，尤其是床旁或社區檢測，會具有廣闊的應用前景。