剝脫型青光眼LOXL1基因多態性分析

蘭蘭，雷方

（1.河南科技大學第一附屬醫院眼科，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學，河南 洛陽 471000）

剝脫綜合征(exfoliation syndrome，XFS)最早由Linberg 于1917 年提出,主要癥狀是眼前段灰白色纖維狀或頭皮屑狀剝脫,沉積于瞳孔邊緣、虹膜表面、晶狀體表面和懸韌帶、前房[1]。剝脫物質被認為是由涉及系統結締組織的異常細胞外基質引起的疾病,并且與老年細胞中異常代謝過程有關[2]。這種特征性組織變化可引起廣泛的眼內并發癥,包括青光眼、色素分散、晶狀體半脫位、瞳孔擴張、眼部房水屏障功能受損、虹膜后粘連和角膜內皮退化[3]。青光眼是導致眼睛失明的原因之一,是一種以視神經抑制和視野缺陷為特征的疾病,眼壓的病理性增加是青光眼性視神經病變的主要危險因素,由視神經乳頭充盈不足和缺血引起的眼內微循環障礙是另一種致病因素[4]。本次研究選取2016 年1 月至2019 年2 月在我院治療的剝脫型青光眼患者91例，探討類賴氨酸氧化酶1（LOXL1）基因多態性與剝脫型青光眼發病的關系，研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2016 年 1 月至 2019 年 2 月在我院治療的剝脫型青光眼患者91 例作為觀察組,納入標準：⑴診斷符合《眼科學》中的標準；⑵漢族人群；⑶患者及家屬知情同意。排除標準：⑴有眼部手術史；⑵合并有糖尿病、肝腎功能異常、惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫系統疾病等。同時選取180 例健康志愿者作為對照組 （無青光眼等眼部疾病家族史），觀察組和對照組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 觀察組和對照組一般資料比較

1.2 檢測方法 兩組患者從常規肘靜脈抽取5ml空腹靜脈血，并用乙二胺四乙酸鈉進行抗凝，并儲存在-80℃的冰箱中。通過苯酚抽提法提取DNA，并使用PCR 法和限制性片段長度多態性技術檢測LOXL1 基因多態性的特征[7]。通過紫外分光光度計ND1000 測量 DNA 濃度和純度。光密度 （A）值(260nm/280nm)在 1.8 和 2.0 之間，并且 DNA 純度被認為是可接受的。工作濃度為100μg/ L，樣品在20℃下儲存在冰箱中,備用樣品儲存在80℃的冰箱中，以降低多個凍融樣品降解的可能性。指定特定位 點 的 引 物 ：rs2165241 (F：5'-CTCTAGGGCCCCTTGGAGAAT-3' 和 R：5'-GGCCAGAGGTCTGCTAAGCAC-3'),rs1048661 和 rs3825942(F：5'.ATTC GGClTITGGCCAGGT-3' 和 R：5'-GAACTGCTGCG GGTAGGA-3'[5])。

PCR 法 ：4μl100mg 基 因 組 DNA，20μlPCRMasterMix，1μl(10nmol/L)上游和下游引物，14μlddH20。PCR 反應條件：rs2165241：在 94℃預變性5min, 在 94℃變性 30s, 在 65~60℃退火 1min,在72℃延伸 45s,10 個循環;在 94℃變性 30s,在 60 ℃退火 1min,45℃在 72℃延伸，30 個循環后，72℃再延 長 1min，PCR 產 物 為 321bp。Rsl048661 和rs3825942：在 94℃預變性 5min 后, 在 94℃變性30s，在 58~55℃退火 30s，在 72℃延伸 45s，6 個循環;在 94℃變性 30s,在 55℃退火 30s，在 72℃延伸45°S,29 個循環后,在 72℃進一步延伸 5min,PCR 產物為200 bp。將5μlPCR 產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3 統計學處理 數據分析統計采用SPSS22.0 軟件，年齡采用均數±標準差表示，組間比較使用t 檢驗，計數資料比較使用卡方檢驗，樣本代表性采用Hardy-WeinBerg 遺傳平衡檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 LOXL1 基因三位點多態性情況 LOXL1 基因rs2165241 位點基因型包括 TT、CT 和 CC，rs1048 661 位點基因型包括 GG、GT 和 TT，rs3825942 位點基因型包括 GG、GA 和 AA；觀察組合對照組LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661 和 rs3825942 位點基因型分布符合Hardy-WeinBerg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本有群體代表性。

2.2 兩組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組和對照組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 兩組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組和對照組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 兩組LOXL1 基因rs1048661 位點基因型及等位基因分布比較 觀察組LOXL1 基因rs1048661位點基因型GG 及等位基因G 比例明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

青光眼是由多種危險因素誘發的視神經變性疾病。青光眼患者的視覺損傷的發病機理是由視網膜神經節細胞的細胞凋亡導致眼內壓升高和低灌注誘導的缺血導致視網膜微循環障礙,從而破壞缺血條件下的血管,產生和平衡抗血管生成因子[4]。流行病學研究表明，XFS 發生在世界上所有地理區域，老年人和青光眼患者的發病率更高，在白種人中更為常見,但患病率不同并且隨著年齡的增長而增加，可以影響到世界范圍10%~20%的60 歲以上人群[6]。原發性青光眼分為閉角型和開角型，不同區域患者比例不同。中國原發性閉角型青光眼與原發性開角型青光眼的比例為3.7：1, 新加坡為4.5：1，日本為 1：7.7，歐美國家為 1：5.7[7]。TGFβ 信號通路在人小梁網細胞中誘導LOX 基因的表達，提示該基因可能影響由眼壓和房水流出阻力引起的青光眼[8]。

表2 兩組LOXL1 基因rs2165241 位點基因型及等位基因分布比較

表3 兩組LOXL1 基因rs3825942 位點基因型及等位基因分布比較

表4 兩組LOXL1 基因rs1048661 位點基因型及等位基因分布比較

LOXL1 是賴氨酸氧化酶家族的成員。賴氨酸氧化酶是含銅的細胞外酶,編碼的蛋白質具有多種生物學功能,其功能是通過賴氨酸氧化脫乙酰化或賴氨酸的羥基側鏈式作用催化膠原蛋白和彈性蛋白在結締組織中的共價交聯,其產物是彈性纖維系統形成的關鍵酶[8]，家族包括五個特殊成員：賴氨酸氧化酶（LOX）和賴氨酸氧化酶樣1-4（LOXL1，LOXL2，LOXL3 和 LOXL4）[9]。LOXL1 是細胞外基質代謝中的關鍵交聯酶，位于15q22，編碼賴氨酸氧化家族的成員,其在交聯的膠原蛋白和彈性蛋白中形成，在彈性纖維的形成，維持和重塑中起重要作用[10]。通過對子宮內膜異位癥中LOXL1 基因表達的研究，LOXL1 可能參與子宮內膜異位癥的病理生理過程, 這與盆腔器官組織脫垂的程度有關[11]。Thorleifsson[12]等人通過研究剝脫性青光眼LO XL1 的常見序列變異, 發現LOXL1 與剝脫性青光眼之間存在顯著相關性。

2007 年，Thorleifsson 等[13]報道了 LOXL1 基因中的3 個單核苷酸多態性（SNPs）位點,而rs2165 241，rs3825942 和 rs104866l 與剝脫性青光眼有很強的相關性。許多研究證實，LOXL1 基因等位基因頻率，基因型，基因單倍型和復雜基因型在不同人群中存在差異，LOXL1 基因多態性是導致剝脫性青光眼遺傳易感性的一個因素[14-16]。本次研究結果顯示LOXL1 基因rs2165241 位點基因型包括TT、CT 和 CC，rs1048661 位點基因型包括 GG、GT 和TT，rs3825942 位點基因型包括 GG、GA 和 AA；觀察組合對照組 LOXL1 基因 rs2165241、rs1048661和rs3825942 位點基因型分布符合Hardy-Wein-Berg 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本有群體代表性。兩組LOXL1 基因位點基因型及等位基因分布比較，觀察組和對照組LOXL1 基因rs2165241 位點和rs3825942weid 基因型及等位基因分布比較差異均無統計學意義，觀察組LOXL1 基因rs1048661位點基因型GG 及等位基因G 比例分別為62.64%和80.22%，明顯高于對照組，差異比較有統計學意義。顯示與XFS 患者的遺傳易感性相關，并且每個多態性位點具有較強的相關性，rs2165241 位點的基因型TT 是危險的基因型，等位基因T 是危險的等位基因，即相同區域內全血DNA 分析rs2165241位點TT 基因型和T 等位基因的發生與XFS 呈正相關。Rsl048661 位點的等位基因G 是一個危險的等位基因，即同一區域群體的全血DNA 檢測分析與rsl048661 位點的G 等位基因中XFS 的發生呈正相關。Rs3825942 位點的等位基因G 是一個危險的等位基因，即同一區域群體的全血DNA 檢測分析與rs3825942 位點G 等位基因中XFS 的發生呈正相關[17]。

綜上所述，LOXL1 基因rs1048661 位點多態性與剝脫型青光眼發病可能有一定關系，LOXLl 基因可能是剝脫性青光眼的主要遺傳危險因素，值得進一步研究。