江西地區24例罕見β-地中海貧血患者基因型分析

羅海艷，劉艷秋，謝康，鄒永毅，陸清

（江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西 南昌 330000）

珠蛋白生成障礙性貧血（也稱地中海貧血）,是廣泛分布于全球且危害性極大的血液系統常染色體隱性遺傳性疾病,在中國主要高發于南部省份如廣東、廣西、海南等[1]。根據合成受到抑制的相應珠蛋白肽鏈類型，地中海貧血可分為α-地中海貧血、β-地中海貧血、δ-地中海貧血、γ-地中海貧血、δβ-地中海貧血、εγδβ-地中海貧血[2]。其中最常見的是α-地中海貧血和β-地中海貧血兩類，致病機制主要由于α-珠蛋白或β-珠蛋白基因發生缺陷，致使珠蛋白肽鏈合成不足，使形成血紅蛋白的α-鏈/β-鏈比例失衡，從而導致溶血性貧血[3]。編碼α-珠蛋白的基因位于16 號染色體16p13.3 區域，主要的基因突變類型為大片段缺失突變，約占α-地貧的95%，部分α-地貧由點突變導致，約占α-地貧的5%[4]；編碼 β-珠蛋白的基因位于 11 號染色體11p15.3 區域，主要突變類型為點突變。目前我國已經報道了48 種β-地中海貧血基因點突變，其中常見的17 種β-地貧基因點突變，CD41-42（HBB：c.124_127delTTCT）、CD43（HBB：c.130G＞T）、IVSII-654（HBB：c.316-197C＞T）、-28（HBB：c.-78A＞G）、-29（HBB：c.-79A＞G）、-30（HBB：c.-80T＞C）、-32（HBB：c.-82C＞A）、CD71-72（HBB：c.216_217insA）、βE （HBB：c.79G＞A）、CD17 （HBB：c.52A＞T）、CD31 （HBB：c.94delC）、CD14-15 （HBB：c.45_46insG）地貧致病基因缺陷已納入常規地貧基因檢測范圍[5-7]。但β-珠蛋白基因上其它的罕見位點突變或未知突變等，需通過Sanger 測序進行檢測。少數β-地貧可由基因大片段缺失所引起,目前我國已報道了5 種大片段缺失導致的β-地中海貧血，包括Gantonese 缺失、Yunnanese 缺失、Chinese 缺失、S.E.Asian 缺失和 Taiwanese 缺失。其中 Chinese 缺失即 β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0,S.E.Asian 缺失即β-東南亞缺失地貧SEA-HPFH,Taiwanese 缺失即β-臺灣型缺失地貧在人群中更為常見。β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0缺失約 79Kb，缺失位置包括 Aγ、δ、和 β 基因，β-東南亞缺失地貧 SEAHPFH 缺失約27 Kb，缺失位置包含整個β 基因，而β-臺灣型缺失在β 基因上缺失約1357bp[8,9]。目前針對β-珠蛋白基因大片段缺失主要采用跨越斷裂點多聚酶鏈反應（Gap-PCR）技術或多重連接酶依賴探針擴增技術（MLPA）方法進行檢測[10,11]。

臨床上, 血液學表型可作為β-地中海貧血患者的篩查指標, 根據RBC 指標和血紅蛋白分析結果可初步診斷不同類型的β-地中海貧血基因攜帶者。β-地貧基因攜帶者一般具有小細胞低色素性貧血（MCV＜80fl、MCH＜27pg）表型，伴隨血紅蛋白電泳 HbA2 值升高（HbA2＞3.5%）。因此，滿足上述血液學表型的患者可視為β-地貧高風險個體。在臨床檢測中, 常規β-地貧基因檢測可檢出絕大部分β-地貧，但仍有少部分β-地貧高危患者可能存在罕見或未知突變而不能通過常規基因檢測方法檢出，容易導致漏診、誤診。因此，對常規基因型檢測結果與表型不符的β-地貧高危患者行進一步β-珠蛋白基因分析相當重要,尤其對于夫妻已有一方攜帶β-地貧基因突變的夫婦, 如另一方也攜帶罕見或未知β-地貧基因突變，會導致生育重型β-地貧患兒的風險大大增加。在這種情況下，我們對β-地貧基因診斷的基本流程為：反向點雜交技術分析常見的β-地中海貧血點突變→Gap-PCR 技術檢測 β-中國型缺失地貧 Gγ+（Aγδβ）0和 β-東南亞缺失地貧SEA-HPFH 及Taiwanese 缺失→β-珠蛋白基因Sanger 測序分析罕見點突變。本研究通過Gap-PCR 技術和Sanger 測序對β-珠蛋白基因罕見突變類型進行診斷，試圖找到β-地貧高危人群的罕見地貧基因突變位點。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 分析 2017 年 5 月至 2019 年 5 月期間于江西省婦幼保健院行β-地貧基因檢測的患者,對符合小細胞低色素性貧血特征,即MCV＜80fL,MCH＜27pg，血紅蛋白電泳 HbA2＞3.5%，而常規 β-地貧基因檢測為陰性的24 例DNA 樣本進行后續β-地貧基因分析。該研究符合人體試驗倫理學標準，并得到了倫理委員會的批準。

1.2 研究方法 對β-基因上可能存在的大片段缺失，參照徐湘民《地中海貧血預防控制操作指南》一書，進行多重Gap-PCR 擴增，對東南亞型HPFH（簡稱 SEA-HPFH）、中國型 Gγ+（Aγδβ）0與 Taiwanese 缺失型進行檢測,設置陽性對照和正常內對照,樣本不同缺失基因型經瓊脂糖電泳后產物片段大小不同。對β-基因上可能存在的罕見點突變與未知突變, 設計2 對引物, 分別擴增HBB 基因上游-100 至 IVS-Ⅱ-81 與 IVS-Ⅱ-70 至下游終止密碼子后Poly-A 兩段，并行Sanger 測序。測序產物與HBB 基因參考序列比較，找出樣本存在的罕見點突變與未知突變。具體操作步驟如下：

1.2.1 DNA 提取 在獲取病人知情同意的前提下，采用天隆核酸提取試劑盒提取200μl 全血DNA，得到 90μl DNA 樣品,調 DNA 濃度為 50～100ng/μl之間備用。

1.2.2 PCR 擴增 以提取好的DNA 樣品為模板，加入 10×PCR Buffer、Taq 聚合酶、2.5mmol/L dNTPs、MgCl2、ddH2O 及 β-珠蛋白基因引物 （由上海生工公司合成），配制好缺失型突變及點突變檢測反應體系, 在ABI 7300 PCR 擴增儀上擴增，β-珠蛋白基因缺失檢測引物序列及擴增程序參照 《地中海貧血預防控制操作指南》一書。β-珠蛋白基因點突變檢測引物序列見表1, 擴增程序為95℃預變性5min；95℃ 45s →62℃ 60s →72℃ 60s，35 個 循 環數；72℃延伸 5min。

1.2.3 產物分析 對進行β-珠蛋白基因大片段缺失型檢測的PCR 產物行瓊脂糖凝膠電泳, 分析是否存在相關缺失型突變；對進行點突變檢測的PCR 產物行 Sanger 測序,與 β-珠蛋白基因 HBB 參考序列比對, 分析是否存在β-珠蛋白基因罕見突變與未知點突變。

表1 β- 珠蛋白基因點突變檢測引物序列

1.2.4 結果分析 電泳結束后，將樣本條帶與陰陽性對照進行比較，判斷其缺失基因型類型。測序完成后，將測序圖譜與HBB 標準參考序列進行比對，找出基因突變位點, 進入http：//globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar 數據庫進行查詢，確定基因突變是否為報道過的已知致病突變或未知突變。

2 研究結果

通過對24 例疑似罕見β-地貧基因患者行Gap-PCR 及Sanger 測序分析，發現24 例患者均存在罕見突變，共計9 種突變類型，突變類型及突變人次如表2 所示。其中缺失型4 例, 點突變型20例, 典型β-珠蛋白基因缺失型突變電泳圖如圖1所示, 典型β-珠蛋白基因點突變測序圖如圖2 所示。

表2 9 種罕見β- 地貧突變類型

3 討論

圖1 典型缺失型罕見β- 地貧瓊脂糖凝膠電泳示意圖

圖2 典型點突變型罕見β- 地貧Sanger 測序圖

β-珠蛋白基因突變導致的重型β-地貧危害極大，患兒出生時不會表現出疾病類型，通常在出生后幾個月或一周歲內開始出現慢性進行性貧血癥狀[12]。患者除嚴重貧血外，易伴有輕度黃疸，肝脾腫大，發育不良，并具有典型的地中海貧血面容，如頭大、眉距增寬、鼻梁低平、顴骨突出等。常并發支氣管炎或肺炎，當并發有含鐵血黃素沉著時，因過多的鐵沉著引起心臟、肝、胰腺、腦垂體等臟器的損害，嚴重時可導致死[13]。重型β-地貧患兒如不加以治療，多于5 歲之前死亡。目前，重型β-地貧尚無理想的治療手段，主要通過長期定期輸血并通過鐵螯合劑進行祛鐵治療，治療繁瑣且費用昂貴，一般情況下患兒和家長都難以接受。造血干細胞移植（HSCT）是目前能根治重型β-地貧的方法，根據干細胞來源可分為骨髓移植、外周血干細胞移植和臍血移植。患兒盡早接受HSCT，移植效果越好，但該方法存在HLA 配型相符的造血干細胞供體來源受限的缺點[14-16]。因此，通過人群篩查發現常見及罕見的β-地貧攜帶者, 并對于攜帶同型地貧基因的育齡夫婦提供產前診斷與遺傳咨詢，有助于合理指導妊娠，降低出生缺陷。

分析結果表明，24 例存在罕見β-地貧突變的樣本中, 包括3 種內含子區突變，4 種外顯子區突變,2 種缺失型突變,所有突變基因型均與其臨床表型相符。可以看出導致β-地貧的基因突變分布區域較廣，在編碼區和非編碼區均有出現。在本次研究中有一些突變位點出現頻率較高，例如：CD54-58(-TATGGGCACCCT) β0雜合突變共計 8 例，-31(A＞G) β+雜合突變共計 3 例。所分析樣本中，檢出 2例β-地貧復合雜合突變,即IVS-II-81(C＞T)復合-28 (A＞C) β＋突變，查詢 HbVar 數據庫提示 IVS-II-81(C＞T)突變可能為中性多態性。對這兩例患者進行家系分析，發現第一名患者的IVS-II-81(C＞T)突變遺傳自母親，其母親血液學表型未見異常；第二名患者的IVS-II-81(C＞T)突變遺傳自父親，其父親血液學表型也未見異常，這更進一步提示IVS-II-81（C＞T）可能為人群中性多態性變異。同時我們發現IVS-I-6(T→G)突變在HbVar 數據庫未見報道，但有文獻報道表明當該位點突變成C 堿基IVS-I-6(T→C)時可導致 β+地中海貧血[17]，因此我們推測IVS-I-6(T→G)也很有可能與該患者的地中海貧血表型相關。

在臨床實踐工作中,對于表型與基因型不符的患者，應行罕見β-地貧基因檢測以明確其基因型，防止誤診或漏診。下列情況應高度懷疑為罕見β-地貧患者：⑴呈小細胞低色素貧血 （MCV＜80fL，MCH＜27pg）且血紅蛋白電泳提示HbA2＞3.5%而常規基因檢測未見異常的患者；⑵呈中、重型β-地貧表型，但常規基因型檢測僅為攜帶者的患者。因此在常規17 種β-珠蛋白基因突變檢測的基礎上，結合多種分子方法對β-地貧高危患者行罕見β-地貧突變分析，可使β-地貧基因檢測更加準確，發現罕見突變或新突變，對指導地貧基因產前診斷、降低出生缺陷具有重要作用。